珍珠蚌肉糜發(fā)酵菌種的篩選及應(yīng)用

◎ 胡 陽，陽寶倩，周子琪，王伯華，楊品紅，周順祥

（1.湖南文理學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，水生動物重要疫病分子免疫技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，常德市農(nóng)業(yè)生物大分子研究中心，湖南 常德 415000；2.順祥食品有限公司，湖南 益陽 413200）

世界淡水珍珠養(yǎng)殖產(chǎn)量的90%來自于我國[1]，淡水珍珠蚌養(yǎng)殖規(guī)模龐大的同時產(chǎn)生了大量采珠后的蚌肉。蚌肉韌性強(qiáng)，腥味較大，極易腐敗變質(zhì)，取珠后的珍珠蚌肉被簡單處理制成飼料，甚至直接廢棄，浪費(fèi)及環(huán)境污染情況嚴(yán)重。蚌肉中的含有豐富的蛋白質(zhì)，其氨基酸營養(yǎng)價值與FAO/WHO推薦的最佳模式接近，且蚌肉中富含各種礦物元素，使蚌肉成為極佳的微量元素來源[2]。此外，其脂肪中不飽和脂肪酸含量高，具有很高的營養(yǎng)價值[3]。據(jù)《本草再新》等記載[4]，蚌肉可治肝熱，托斑疹，解痘毒，明目，止消渴等。因此，珍珠蚌肉資源的綜合利用是亟待解決的課題，且市場前景良好。

發(fā)酵肉制品安全性好、口感獨(dú)特、營養(yǎng)豐富，是提高肉糜資源附加值的有效途徑[5]。發(fā)酵肉制品已經(jīng)成為了發(fā)達(dá)國家的主流肉類產(chǎn)品之一[6]。國民生活水平不斷提高的同時，我國對于發(fā)酵肉制品的需求量也在不斷增長。

發(fā)酵所用菌種和發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)特性是決定發(fā)酵肉糜制品產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵因素[7]。本文嘗試從我國傳統(tǒng)肉制品發(fā)酵菌株中篩選出適宜蚌肉糜發(fā)酵的發(fā)酵劑，并探討發(fā)酵對蚌肉糜產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)參數(shù)、風(fēng)味等品質(zhì)的影響，以期為蚌肉尤其是采珠后的蚌肉進(jìn)行綜合利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

藤黃微球菌ML305、植物乳桿菌LP28、發(fā)酵乳桿菌LF017及干酪乳桿菌LCB22，均為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種；珍珠蚌采自淡水珍珠養(yǎng)殖基地；賴氨酸購自Now Foods天然保健品公司；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器

TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀，英國Stable Micro System公司；UV-1900i分光光度計，島津公司；TGL-16M高速臺式冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；PL203電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SW-CJ-1F潔凈工作臺，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SPX-250B-D振蕩培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的活化

將菌種接種至初始培養(yǎng)基中，在37 ℃、120 r·min-1條件下培養(yǎng)24 h后，在相同條件下，分別移出1 mL菌液，重復(fù)培養(yǎng)，獲得各菌株的初始菌液。

1.3.2 發(fā)酵劑的篩選

（1）不同溫度下菌株的生長情況。將菌種接種至培養(yǎng)基中，設(shè)立20 ℃、30 ℃、40 ℃共3個對照組，培養(yǎng)24 h后測量680 nm處的吸光值。

（2）生長曲線及產(chǎn)酸曲線。接種1%的菌株至各培養(yǎng)基中，置于37 ℃環(huán)境下進(jìn)行初代培養(yǎng)，且每隔6 h測680 nm 處吸光值。將無處理的初始培養(yǎng)基作為對照。每隔12 h使用pH計檢測接種的各培養(yǎng)基的pH值，繪制各菌株的產(chǎn)酸曲線。

（3）耐鹽性。在初始培養(yǎng)基中加入濃度梯度為0%、2%、4%、6%和8%的NaCl溶液，以1%為接種量接種發(fā)酵菌，37 ℃下培養(yǎng)24 h后，每隔6 h檢測680 nm處吸光值。

（4）菌株產(chǎn)蛋白酶能力。用稀釋平板法將菌株接種至加入酪蛋白的初始固體培養(yǎng)基中，置于37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察是否出現(xiàn)透明圈。將無酪蛋白的培養(yǎng)基作為對照。

（5）氨基酸脫羧酶活性。把菌液接種到含有氨基酸的培養(yǎng)基內(nèi)，同時接入不含氨基酸的培養(yǎng)基內(nèi)作為對照，分別置于有氧和厭氧條件下，37 ℃培養(yǎng)48～72 h后，觀察菌落周圍顏色變化，若存在顏色變化，即為陽性。反之則為陰性。

（6）蚌肉汁浸液的制備。接種1%的菌株至30%的蚌肉汁中，在37 ℃下培養(yǎng)，每隔8 h測定各浸液的pH值，來觀察菌株對珍珠蚌肉的利用特性。

1.3.3 發(fā)酵型蚌肉糜的制備

（1）發(fā)酵蚌肉糜凝膠的制備。原料肉糜處理→混勻食鹽、葡萄糖等輔料→接種發(fā)酵劑（接種量4%）→攪勻擂潰→灌制→發(fā)酵→4 ℃冷藏12 h→待測。基礎(chǔ)配方為2%料酒、6%大豆分離蛋白、0.5%卡拉膠、5%植物油、1.5%味精、3%香辛混合料、2% NaCl和4%葡萄糖。

（2）熱處理蚌肉糜凝膠的制備。原料肉糜處理→混勻食鹽、葡萄糖等輔料→攪勻擂潰→灌制→兩段式加熱（70 ℃水浴30 min+90 ℃水浴15 min）→4 ℃冷藏12 h→待測。基礎(chǔ)配方同上。

1.3.4 質(zhì)構(gòu)指標(biāo)檢測

使用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行質(zhì)構(gòu)特性測定。選用P/30探頭進(jìn)行測定。將質(zhì)構(gòu)儀調(diào)為TPA模式，測定條件為：以5 kg為力感應(yīng)源，測試前、中、后速度均為1 mm·s-1，壓縮距離14 mm，感量5 g。以硬度、彈性、內(nèi)聚性、咀嚼性為表征指標(biāo)，測試3次取平均值[8]。

1.3.5 感官品評標(biāo)準(zhǔn)

產(chǎn)品的感官評定根據(jù)文獻(xiàn)[9]略作修改。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度下菌株的生長情況

在適量高溫條件下進(jìn)行發(fā)酵，可一定程度上縮短發(fā)酵劑的延滯期，使其生長繁殖更加旺盛，更加利于肉制品的發(fā)酵[10]。由圖1可以得出，4株測試菌株在20～40 ℃時均生長情況良好，能夠滿足發(fā)酵肉制品的生產(chǎn)要求。其中，LP28、LF017和LCB22這3種菌株略優(yōu)于ML305。

圖1 溫度對各菌株生長情況的影響圖

2.2 生長曲線及產(chǎn)酸曲線

生長曲線可以直觀地反映出生長過程中菌體活力的變化。一般選擇對數(shù)期末期、穩(wěn)定期前期階段作為最佳收獲時間[11]。從圖2可以得出，37 ℃培養(yǎng)條件下，除ML305外，其余菌株均能迅速進(jìn)入對數(shù)生長期，并在21 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，生長速率相似。其中LP28生長速率最快，其次是LCB22和LF017。3種桿菌的最佳收獲期均在21 h 左右。

圖2 各菌株的生長曲線圖

pH值是決定發(fā)酵食品安全性的一個重要因素。為了抑制病原菌生長，要選擇產(chǎn)酸能力強(qiáng)的菌株。測定各菌株48 h內(nèi)的產(chǎn)酸情況，結(jié)果見圖3。可知，LF017、LCB22、LP28這3種桿菌均能在24 h內(nèi)將pH值降低至5以下，產(chǎn)酸能力較強(qiáng)。相比之下ML305的產(chǎn)酸能力較弱，未能在較短時間內(nèi)將pH值降至5.0以下。

圖3 不同菌株在培養(yǎng)過程中pH值的變化圖

2.3 耐鹽性

肉制品發(fā)酵劑培養(yǎng)物的耐鹽性通常是6%。含鹽量過低，對腐敗菌的生長沒有明顯的抑制作用。而鹽濃度過高，抑制腐敗菌的同時也會抑制發(fā)酵菌的生長，影響發(fā)酵的正常進(jìn)行，同時還會導(dǎo)致產(chǎn)品風(fēng)味不佳、鮮嫩度低[12]。測定不同NaCl濃度下各菌株培養(yǎng)24 h的吸光度值如圖4所示，4種菌株都會受到鹽濃度的影響。隨著食鹽濃度增加，菌株生長受到的抑制增強(qiáng)。4株菌種中對食鹽最不敏感的是ML305，對食鹽較為敏感的是LCB22。

圖4 不同NaCl濃度下各菌株培養(yǎng)24 h的吸光度值圖

2.4 菌株產(chǎn)蛋白酶能力

胺類物質(zhì)會導(dǎo)致產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)，影響產(chǎn)品的安全性。而胺類物質(zhì)可以由發(fā)酵劑將游離的氨基酸脫羧、脫氨產(chǎn)生。無蛋白酶的發(fā)酵劑可以產(chǎn)生某種特殊的酶，加快蛋白質(zhì)的分解，從而明顯促進(jìn)游離氨基酸和其他風(fēng)味物質(zhì)的形成[13]。菌株產(chǎn)蛋白酶能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1，LCB22表現(xiàn)為產(chǎn)蛋白酶能力陽性，其他3種都表現(xiàn)為陰性，無產(chǎn)蛋白酶能力。

表1 不同菌株產(chǎn)蛋白酶的情況表

2.5 氨基酸脫羧酶活性

在發(fā)酵食品領(lǐng)域，常選擇無氨基酸脫羧酶活性的菌株作發(fā)酵劑，以控制高蛋白食品中的生物胺含量[14]。測試4種菌株氨基酸脫羧酶的活性，結(jié)果如表2。由表2可知，4種菌株的氨基酸脫羧酶活性均呈陰性。

表2 不同菌株產(chǎn)氨基酸脫羧酶的情況表

2.6 微生物發(fā)酵蚌肉汁

各菌株接種至30%蚌肉汁中發(fā)酵培養(yǎng)48 h后，觀察各菌株發(fā)酵蚌肉汁時產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、產(chǎn)粘液及感官特性的情況。結(jié)果見表3。上，LP28的生長速率高，產(chǎn)酸能力強(qiáng)，耐鹽性好，無產(chǎn)蛋白酶能力和氨基酸脫羧酶能力，適宜作為發(fā)酵劑，其次是LF017。LCB22的生長速率高，產(chǎn)酸能力強(qiáng)，但因其耐鹽性差，有產(chǎn)蛋白酶能力，故不適宜作發(fā)酵劑。ML305生長較慢、產(chǎn)酸能力弱，且對鹽敏感，不符合篩選要求，不適宜作發(fā)酵劑。后續(xù)試驗(yàn)均采用LP28作為發(fā)酵劑。

表3 不同菌株在30%蚌肉汁中的生長情況表

2.7 發(fā)酵對產(chǎn)品的影響

2.7.1 發(fā)酵對產(chǎn)品凝膠特性的影響

對發(fā)酵前后的蚌肉糜制品進(jìn)行質(zhì)構(gòu)的測定，結(jié)果如表4所示。經(jīng)發(fā)酵后，蚌肉糜產(chǎn)品的硬度、咀嚼性、彈性分別提高了34.6%、73.6%、6.5%，內(nèi)聚性下降了10.5%。綜合4種指標(biāo)來看，發(fā)酵蚌肉糜的凝膠特性有所提高。

表4 發(fā)酵前后蚌肉糜制品凝膠特性比較表

其中LP28和LF017顯示出良好的發(fā)酵性能。綜

2.7.2 發(fā)酵對產(chǎn)品感官的影響

對發(fā)酵前后的蚌肉糜制品進(jìn)行感官評價，結(jié)果如表5。相比之下，發(fā)酵組樣品色澤更為均勻，腥味有所減少，肉香味更濃，且彈性更佳。

表5 發(fā)酵前后蚌肉糜制品感官評價比較表

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)以珍珠蚌肉為原料，進(jìn)行發(fā)酵蚌肉糜制品的發(fā)酵劑篩選，并通過發(fā)酵改善了蚌肉糜制品的質(zhì)構(gòu)、感官等品質(zhì)特征。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LP28發(fā)酵劑的生長速率最快，且產(chǎn)酸能力最佳，耐鹽性較強(qiáng)，無產(chǎn)蛋白酶能力，無氨基酸脫羧酶活性，可以作為合適的發(fā)酵劑；LF017的各發(fā)酵特性次之，但也可用于珍珠蚌肉糜的發(fā)酵；LCB22的耐鹽性差，且有產(chǎn)蛋白酶能力，不宜作為發(fā)酵劑。ML305的生長速率過慢，產(chǎn)酸能力差，耐鹽性差，不宜作為發(fā)酵劑。相較于未發(fā)酵蚌肉糜，經(jīng)發(fā)酵后，蚌肉糜的硬度、咀嚼性、彈性值均升高，內(nèi)聚性略微下降，產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)得到一定改善，感官評價亦更佳。這些結(jié)果為以珍珠蚌肉為原料開發(fā)發(fā)酵型肉糜制品提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。