珍珠龍膽石斑魚優勢腐敗菌的分離鑒定及抑菌試驗

于淑池，吳 靜，梁宇晴，李 燁，邢文君，周玲玲

(海南熱帶海洋學院 食品科學與工程學院，海南 三亞 572022)

0 引言

茶多酚(Tea polyphenols TP)作為植物源天然抗氧化劑，具有安全性高、抗菌性強、無毒副作用等特點，在食品保鮮領域應用較為廣泛[10]，目前茶多酚對水產品腐敗菌的抑制作用報道較少[11]9,[12]44,[13]。本研究首先確定4 ℃冷藏珍珠龍膽石斑魚的貨架期，通過傳統培養基法結合16S rDNA技術分離鑒定貨架期終點的優勢腐敗菌，以茶多酚為抑菌劑，探討其對冷藏珍珠龍膽石斑魚優勢腐敗菌的抑菌作用，以期為珍珠龍膽石斑魚腐敗菌的靶向抑菌、延長貨架期提供理論基礎。

1材料與方法

1.1材料

珍珠龍膽石斑魚(體質量740±16 g)：采購于三亞市荔枝溝路樂天城農貿市場。

培養基及試劑：平板計數培養基(PCA)，北京陸橋技術股份有限公司；營養瓊脂，北京奧博星生物技術有限責任公司；酵母提取物，廣東一品鮮生物有限公司；茶多酚(純度>99%)，食品級，河南千志商貿有限公司。

儀器：SW-CJ-1FD型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；BCD-649WE型冰箱，青島海爾股份有限公司；SQ510C型立式壓力蒸汽滅菌器，重慶雅馬拓科技有限公司；250B數顯生化培養箱，金壇市盛蘭儀器制造有限公司；Universal Hood II 凝膠成像儀、DYY-10C型電泳儀，BIO-RAD 中國公司；BSA-2224S型電子天平，斯沃德北京儀器設備有限公司。

1.2方法

1.2.14 ℃冷藏珍珠龍膽石斑魚貨架期的測定

購買鮮活珍珠龍膽石斑魚運回實驗室，致死后放在碎冰上進行“三去”(去頭、去鱗、去內臟)處理后，用刀沿背脊部剖為兩半后取脊背肉，并切成重量為20 g 左右的魚片；用自封袋密封后置于4 ℃冰箱貯藏，每隔2 d取樣，對珍珠龍膽石斑魚片的感官品質、總揮發性鹽基氮(TVB-N) 、菌落總數和pH 指標進行測定，每種樣品平行處理3次，取均值。

感官評價參照于林等[14]對石斑魚的感官評價方法，10名經過培訓的評定員，每隔2 d對珍珠龍膽石斑魚片的色澤、氣味、彈性和組織形態進行感官評分，以4個項目評分總和的算術平均值作為感官評分結果，6分以下為感官臨界點；揮發性鹽基氮指標的測定參照GB 5009.228-2016《食品中揮發性鹽基氮的測定》中的半微量定氮法進行；菌落總數測定參照國標 GB 47892-2016《菌落總數的測定》的標準；pH測定參考藍蔚青等[15]226的方法進行。

1.2.24 ℃冷藏珍珠龍膽石斑魚腐敗菌的分離純化與鑒定

(1)腐敗菌的分離純化

參照文獻[16-17]方法進行腐敗菌的分離純化。根據貨架期的測定結果，無菌條件下取貨架期終點冷藏的珍珠龍膽石斑魚肉20 g加入180 mL生理鹽水(無菌)均質，進行10倍比稀釋，選取10-1～10-6稀釋梯度，每個稀釋度吸取100 μL涂布于平板計數瓊脂培養基PCA平板上，倒置于30 ℃恒溫培養箱培養48 h；選取菌落數分散比較均勻的平板，觀察并記錄菌落特征，同時進行革蘭氏染色、接觸酶測試，并計算同種菌落細菌占菌落總數的比例，進一步挑取典型的單菌落，重復平板劃線至少3次以上，得到純化的單菌落。進一步進行16S rDNA序列分析。

(2)16S rDNA 分析

將貨架期終點純化得到的占比較高的3株腐敗菌進行菌落PCR，以檢測是否為純種；向1.5 mL離心管中加入雙蒸水1 μL，用小移液管的尖頭處蘸取單菌落接進雙蒸水中，加入引物27f/1541r模板各2 μL，2×Master Mix 25 μL；PCR反應程序：預變性94 ℃、5 min，變性設1 min，退火55 ℃、1 min，72 ℃延伸2 min，30個循環，最后72 ℃再延伸5 min，4 ℃冰箱保存。擴增產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，條帶單一后，將PCR擴增產物送至通用生物系統(安徽)有限公司進行16S rDNA 的序列分析。測序結果登陸NCBI網站進行同源性分析，采用MEGA 7.0.26軟件進行序列對比，并構建系統進化樹。

1.2.3 抑菌試驗

(1)茶多酚對貨架期終點3株優勢腐敗菌的抑菌作用測定

茶多酚的配置：將100 mg 茶多酚溶解于5 mL 0.15 mmol·L-1H3PO4中，配成濃度為20 mg·mL-1的母液，采用濾膜(0.22 μm)過濾除菌后，保存于為-20 ℃冰箱備用。

抑菌作用測定參照于淑池等[18]的方法。將冷藏珍珠龍膽石斑魚貯藏貨架期終點分離鑒定的3株菌，即苺實假單胞菌、哈夫尼希瓦氏菌、液化沙雷氏菌接種于LB肉湯培養基，搖床振蕩(30 ℃，160 r·min-1)過夜培養活化后，以2%比例接種于LB液體中，繼續培養至OD600 nm約為0.5左右，用移液槍吸取菌液100 μL，均勻涂布于LB固體培養基，牛津杯打孔，每孔加入不同濃度(0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mg·mL-1)茶多酚溶液50 μL，30 ℃培養箱靜置培養24 h，觀察3株菌的生長抑制情況，采用十字交叉法測量抑菌圈直徑大小，測量3次取平均值。

(2)最小抑菌濃度(MIC)測定

采用平板涂布法[19]測定MIC，根據抑菌試驗結果，將茶多酚母液采用二倍比稀釋成6個濃度，苺實假單胞菌、哈夫尼希瓦氏菌、液化沙雷氏菌測定的濃度選擇分別為0.725、1.45、2.9、5.8、11.6 mg·mL-1；0.375、0.75、1.5、3.0、6.0、12.0 mg·mL-1；0.425、0.85、1.7、3.4、6.8、13.6 mg·mL-1；分別吸取2 mL不同濃度茶多酚溶液于無菌平皿內，再倒入冷卻至45 ℃左右的LB瓊脂培養基18 mL，冷卻凝固后，于平板中均勻涂布100 μL菌液，30 ℃倒置培養24 h，以完全沒有菌生長的最低濃度為茶多酚的MIC，每個濃度重復操作3次。

1.3數據處理

實驗數據采用Excel處理并作圖，利用MEGA 7.0.26軟件對菌株16SrDNA序列進行比較，構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.14 ℃貯藏下珍珠龍膽石斑魚貨架期的確定

2.1.1 貯藏期間感官評分與TVB-N測定結果

由10名訓練有素感官評價人員組成評定小組，對4 ℃貯藏下珍珠龍膽石斑魚進行感官評分；同時測定貯藏期間TVB-N值(用TVB-N表示)的變化，結果見圖1。

圖1 4 ℃貯藏條件下珍珠龍膽石斑魚感官評價與揮發性鹽基氮測定結果

由圖1可知，隨著貯藏時間延長，珍珠龍膽石斑魚的感官評分呈下降趨勢。貯藏至第6天時，感官評分為6分，達到臨界值，所以選擇6 d為珍珠龍膽石斑魚4 ℃貯藏下的感官可接受終點。

TVB-N指標是指肉類及水產品的蛋白質等含氮物質，在微生物和酶的作用下，分解產生揮發性堿性含氮物質如氨類和胺等的數量[20]，與鮮度有較高的相關性，是評價水產品新鮮度的重要指標，參考鮮海水魚通則GB/T 18108-2019，TVB-N≤15 mg·100 g-1為一級鮮度；TVB-N≤30 mg·100 g-1為合格品。從圖1看出，隨著貯藏時間的延長，TVB-N呈不斷上升的趨勢，第6天為16.8 mg·100 g-1，超過一級鮮度的臨界值，第8天為32.2 mg·100 g-1，已超過臨界值。以TVB-N為指標判定的鮮度變化情況稍滯后于以感官品質為指標判定的結果。

2.1.2 貯藏期間pH值與菌落總數測定結果

4 ℃貯藏期間石斑魚魚肉pH值和菌落總數測定結果見圖2。

圖2 4 ℃貯藏條件下珍珠龍膽石斑魚pH值與菌落總數測定結果

一般水產品一級鮮度pH值為6.5～6.8，二級鮮度為6.9～7.0，pH值≥7.1時魚肉腐敗[21]。由圖2可知，第0天的pH值為6.6，第4天pH值下降到6.3，第8天pH為7.1，達到腐敗臨界值。貯藏初期糖原酵解產生乳酸，同時ATP、磷酸肌酸等物質也會分解產生磷酸等酸性物質，使pH值下降；4天以后pH值逐漸上升，是因為蛋白質分解產生堿性物質如揮發性的氨類等引起[15]227,[22]。

Al-Daqal等[23]提出可食用水產品的菌落總數(TVC)上限是6.0 lg(cfu·g-1)；當菌落總數超過上限值，表明魚肉已經腐敗。圖2顯示，珍珠龍膽石斑魚菌落總數的變化隨貯藏時間的增長逐漸變大，初始值為0.4 lg(cfu·g-1)，第10天達到6.5 lg(cfu·g-1)，以菌落總數為依據判斷珍珠龍膽石斑魚在第8～10天內達到腐敗。

綜上，感官在第6天達到腐敗終點，揮發性鹽基氮和pH值在第8天達到臨界值，菌落總數在第10天超出水產品可食用的菌落總數上限。以感官評分為確定貨架期的主要指標，確定4 ℃貯藏珍珠龍膽石斑魚的貨架期為6 d。

2.2 4℃貯藏珍珠龍膽石斑魚腐敗菌的篩選分離

2.2.1腐敗菌的分離純化

采用平板計數瓊脂培養基，從4 ℃珍珠龍膽石斑魚貨架期終點共分離出7株菌，其單菌落特征和革蘭氏染色結果見圖3。

圖3 4 ℃貯藏條件下珍珠龍膽石斑魚腐敗菌的單菌落形態及革蘭氏染色結果

圖3的菌落特征顯示，7株菌均已純化為特征一致的單菌落；革蘭氏染色結果顯示，只有P3為革蘭氏陽性菌，其余6株菌均為陰性，陰性菌比例為85.7%，說明在貨架期終點，革蘭氏陰性菌占絕對優勢，從形態看，菌株P3為球形，其余為桿形或短桿形。7株菌的相關特征描述及比例統計結果見表1。

表1 貨架期終點(6 d)腐敗菌的主要特征

由表1可知，7菌株菌落顏色為白色、黃色或淡黃色，除P2邊緣不整齊、P3菌落表面干燥、平坦外，其他均為表面光滑，濕潤，邊緣整齊，隆起；除P3為革蘭氏陽性菌外，其他6菌株均為革蘭氏陰性菌；除P4接觸酶陰性外，其余均為陽性；相同菌落數統計結果顯示，P2(21.2%)、P4(28.9%)、P7(35.5%)3菌株占比較高，后續對占比高的3株菌(P2、P4、P7)進行基因序列分析并鑒定。

2.3 珍珠龍膽石斑魚腐敗菌的鑒定及系統進化樹的構建

2.3.1 3株菌的16S rDNA基因序列分析

對貨架期終點篩選的比例較高的3株(P2、P4、P7)優勢腐敗菌進行分子鑒定，以優勢腐敗菌的總 DNA 為模板進行菌落PCR，以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測菌落純度，電泳結果見圖4。

圖4 菌株的 16S rDNA 電泳圖譜

從圖4可見，在 1.5 kb 附近3株菌均出現單一條帶，顯示PCR 擴增比較成功，可用于后期測序。將PCR 產物送至通用生物系統(安徽)有限公司進行測序，通過 NCBI 軟件將測序結果選取同源性最高的菌株序列，采用 MEGA 軟件進行多重序列對比，構建系統進化樹。菌株種屬分析結果見圖5、表2。

圖5 3株腐敗菌的系統進化樹構建

表2 3株腐敗菌的鑒定結果

從圖5、表2可以看出，液化沙雷氏菌(P2)、哈夫尼希瓦氏菌(P4)、苺實假單胞菌(P7)與最大相似菌株的相似度均在98%以上，表明鑒定結果充分可靠。

朱軍莉等[24]研究認為，假單胞菌屬、希瓦氏菌屬、腸桿菌科等腐敗菌均是蛋白分解能力強的嗜冷性革蘭氏陰性菌，是引起有氧冷藏水產品腐敗變質的主要腐敗菌；水產品的腐敗變質主要是由水環境及捕撈后的外源腐敗菌引起，貯藏條件不同，引起水產品腐敗變質的腐敗菌種也有所不同[25],不同水域的魚、貝類等水產品在有氧冷藏條件下[26]或冷鏈流通中[27]的特定腐敗菌多為假單胞菌和(或)希瓦氏菌屬；其中假單胞菌屬會使水產品產生大量小分子醛、酮、酯及有異味的揮發性代謝產物而導致腐敗[28]；海水魚中廣泛存在的是希瓦氏菌屬[29]，希瓦氏菌產硫能力較強[30]，可以產生大量硫化物，同時能夠形成黏附能力較強的生物膜[31]，使其黏附在水產品表面，引起腐敗變質；沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)是真空包裝和氣調包裝魚肉中的優勢腐敗菌[32]，屬于條件致病菌，可以分解肉類蛋白質，或產紅色色素，引起肉類及其制品的腐敗變質[33]。

2.4 茶多酚抑菌試驗結果

茶多酚對液化沙雷氏菌、哈夫尼希瓦氏菌、苺實假單胞菌3株優勢腐敗菌的抑菌效果見表3。

表3 茶多酚對3株優勢腐敗菌的抑菌效果

表3顯示，茶多酚對3株優勢腐敗菌均具有較好的抑菌作用，隨著茶多酚濃度的增加，抑菌圈直徑逐漸增大，相比而言，對苺實假單胞菌的抑制作用最好，液化沙雷氏菌最弱。

根據抑菌作用結果，進一步測定得到茶多酚對苺實假單胞菌、哈夫尼希瓦氏菌、液化沙雷氏菌的最小抑菌濃度分別為2.9 mg·mL-1、3.0 mg·mL-1、3.4 mg·mL-1。由此可見，茶多酚對3株菌的抑制作用比較接近，相對而言對苺實假單胞菌的抑制作用最強，最小抑菌濃度為2.9 mg·mL-1，對液化沙雷氏菌抑制效果最差，最小抑菌濃度為3.4 mg·mL-1。黃旭鎮[11]25采用菌落計數法測定發現，茶多酚對大黃魚源波羅的海希瓦氏菌的MIC為0.75 mg·mL-1，孫京新等[34]采用牛津杯法測定茶多酚對假單胞菌的MIC為3.0 mg·mL-1，牛津杯法測定得最小抑菌濃度要比計數法偏高一些[35]，劉五高等[12]46采用平板擴散法測定茶多酚對肺炎克雷伯菌的MIC為1.024 mg·mL-1，可見不同的細菌對茶多酚的敏感性不同，同時MIC的大小也與測定方法有一定關系。

3 結論

根據感官評價、TVB-N、pH值及菌落總數等指標的測定結果，得出4 ℃貯藏下珍珠龍膽石斑魚貨架期是6 d。采用PCA 平板對珍珠龍膽石斑魚貨架期終點的腐敗菌進行分離純化，共分離篩選出7株菌，革蘭氏陰性菌占比高達為85.7%；對貨架期終點占比較高的3株腐敗菌(P2、P4、P7)進行鑒定，進化樹分析確定P2為液化沙雷氏菌、P4為哈夫尼希瓦氏菌、P7為苺實假單胞菌；抑菌試驗結果表明，茶多酚對液化沙雷氏菌、哈夫尼希瓦氏菌、苺實假單胞菌均具有抑制作用，且抑菌效果具有濃度依賴性，最小抑菌濃度分別為3.4 mg·mL-1、3.0 mg·mL-1、2.9 mg·mL-1。

(責任編輯：李由明)