燕窩分子生物學檢測技術研究進展

白偉娟 張小江 蕭月娥 柳訓才 范群艷 徐敦明 張曉婷 鄧曉軍

摘 要：分子生物學檢測方法以其高效、靈敏、準確、快速的特點在食品行業真偽辨別中備受歡迎。該文主要介紹了燕窩檢測中的聚合酶鏈式反應、實時熒光PCR、分子指紋、基因芯片、基因測序等基因檢測技術研究現狀，為后續燕窩真偽鑒別提供參考依據。

關鍵詞：燕窩;分子生物;真偽鑒別

中圖分類號 TS207 ? 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2021）20-0018-04

Research Progress on Molecular Biology Detection Technology of Edible Bird′s Nest

BAI Weijuan1 et al.

（1Yan Palace Seelong Food Co.， Ltd.， Nest Technology Center， Xiamen 361100， China）

Abstract： Molecular biology detection methods are popular in the authenticity identification of the food industry due to their high efficiency， sensitivity， accuracy and speed. This article mainly introduces the polymerase chain reaction，real-time fluorescent PCR， molecular fingerprinting， gene chip， gene sequencing and other gene detection technologies in bird′s nest detection， and provides a reference for subsequent identification of edible bird nest authenticity.

Key words： Edible? bird′s nest （EBN）; Molecular biology; Authentication

燕窩（edible bird′s nest，EBN）由金絲燕屬（Aerodramus）和侏金絲燕屬（Collocalia）7種小型鳥組成，在繁殖過程中唾液腺分泌物與羽毛或草混合而成[1]。金絲雀的生長和繁殖需要具備充足的食物來源、約90%濕度及28～30℃溫度的適宜環境條件[2]。因此，金絲雀僅分布在條件適宜的地區，如印度尼西亞、馬來西亞、泰國、越南等國家。隨著經濟水平的提高，加上疫情下國民對大健康的重視，燕窩市場呈現逆勢上揚的趨勢。中國市場流通的燕窩100%依賴進口，2020年度我國進口燕窩量高達345t，同比2017年進口量81.4t，增加了4倍。2020年天貓購物平臺燕窩類銷售額約為44.5億元，同比2019年增長39%。燕窩具有豐富的營養價值，具有提高嬰兒智力和記憶力[3]、抗病毒[4-5]、抗氧化[6-7]、抗腫瘤[8]、提高人體免疫力[9-12]、抗凝血[13]、改善皮膚[14]等功能。在中國人長期的認知中，食用燕窩已經成為一種健康的飲食習慣。因此，隨著生活水平的逐步提高，人們對燕窩的需求量也在增加。但由于產量減少而利潤豐厚，市場上充斥著摻假品和低質量的燕窩，且由于國內外缺乏有關燕窩質量的法規和標準，使有效市場監控變得十分困難。無休止的非法手段，例如摻假或染色等，使市場陷入惡性競爭圈。消費者對燕窩缺乏常識，很容易被不道德的商人和不負責任的輿論所誤導。N-乙酰基神經氨酸（唾液酸）是由金絲燕口腔上皮細胞及其絨羽組成，作為燕窩中主要生物活性成分，其可提供相關生物信息，可作為判斷真假及品質好壞的依據。

基因是帶有遺傳信息的DNA片段，具有物質性（存在方式）和信息性（根本屬性）雙重屬性，因此利用基因手段對生物物種進行鑒定是科學可靠的。隨著生物學的快速發展，基因檢測方法不斷涌現，如PCR技術、基因測序、基因圖譜、基因芯片、分子指紋等。分子生物學檢測手段以其高靈敏度、快速方便、特異性好等特點，在燕窩制品真偽鑒別中得到了廣泛應用。燕窩主要是由唾液酸糖蛋白組成，其水體液中發現多種主要以黏蛋白形式存在的水溶性蛋白，不易分離純化。研究發現，利用液相等點聚焦電泳，使燕窩水提蛋白質后再用丙酮沉淀能有效去除其雜質分離效果更好，適用于電泳分析試驗[15]。同時，也有研究報道關于燕窩中的蛋白質的制備方法，利用80%丙酮來沉淀蛋白質可有效去除雜質，使其分離效果更佳[16]。劉鳴暢等[17]研究表明，毛細管凝膠電泳技術適用于摻假燕窩中銀耳成分得檢測。刁雅欣等[18]通過提取燕窩DNA基因，利用動物類通用COI基因進行PCR擴增，建立了NJ系統發育樹，對13個樣本進行了鑒別分析，其中13個樣品與Aerodramus fuciphagus的COI DNA序列相似度高于99%，說明DNA條形碼技術可作為燕窩基源判斷技術之一。王鳳云等[19]對不同品種及產地燕窩提取其DNA，利用ND2序列進行擴增測序，構建了NJ系統發育樹，結果表明，市場上官燕的均為爪哇金絲燕（Aerodramus fuciphagus）或其亞種A. fuciphagus germani，為后續生物鑒別研究奠定了基礎。

1 PCR技術在燕窩中應用

PCR技術模擬DNA天然復制過程，在體外DNA的特異序列進行擴增，從而獲得大量的同一序列。與擴增特異性密切相關的因素是與待擴增的特異序列兩端互補的2個寡核苷酸引物（上游引物和下游引物）。該技術是基因擴增技術的一次重大改革，是分子生物學發展史中的一個重要里程碑，經過一系列研究產生了限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應（PCR-RFLP）技術、原位PCR技術、多重PCR技術、巢式PCR（NEST PCR）技術、反向PCR（Inverse PCR，IPCR）技術、錨定PCR（Anchored PCR，APCR）技術、反轉錄PCR（reverse transcription，RT-PCR）技術、修飾引物PCR技術、等位基因特異性PCR（Allele-specific PCR，ASPCR）技術、單鏈構型多肽性PCR（single-strandconformational polymorphism PCR，SSCPPCR）技術、競爭性PCR（competitive PCR，c-PCR）技術、差示PCR（differential PCR，d-PCR）技術等技術在檢測方面的運用。RT-PCR技術的產生使PCR技術產生了質飛躍，其最主要特點是定量范圍寬、靈敏度高，并能同時處理多個樣本。