濃香型白酒釀造環(huán)境中酵母的篩選及其組合發(fā)酵特性

劉 宇，管桂坤，萬(wàn)自然，袁 寧，劉明坤，左 翔

（山東蘭陵美酒股份有限公司，山東臨沂 277731）

濃香型白酒在窖內(nèi)的發(fā)酵依賴(lài)于環(huán)境、大曲、窖泥中各種微生物的共同參與，經(jīng)過(guò)微生物的代謝和復(fù)雜的生化反應(yīng)形成了以己酸乙酯為主體復(fù)合香的香味物質(zhì)，賦予濃香型白酒“窖香濃郁、綿甜爽冽、香味協(xié)調(diào)、尾凈味長(zhǎng)”的特點(diǎn)。濃香型原酒中的香味成分主要來(lái)源于酯類(lèi)物質(zhì)，主要包括己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯等，四大酯的含量及其量比關(guān)系決定了濃香型白酒的品質(zhì)和風(fēng)格[1]。近幾年，大多數(shù)酒企出現(xiàn)濃香型原酒中乙酸乙酯不同程度偏高的問(wèn)題，造成己乙比失調(diào)或者嚴(yán)重失調(diào)，聞香香氣欠正、帶有青干氣、味短且平淡，嚴(yán)重影響了后期勾調(diào)，成為白酒行業(yè)亟待解決的重要問(wèn)題。目前，濃香型白酒中乙酸乙酯的相關(guān)研究主要集中在從理論和實(shí)踐生產(chǎn)上探究引起濃香型原酒乙酸乙酯含量偏高的主要原因以及解決辦法[2-5]。

白酒的釀造屬于“多微共酵”的過(guò)程，涉及到復(fù)雜的微生物相互作用以及生理生化反應(yīng)過(guò)程，常規(guī)的單菌培養(yǎng)并不能呈現(xiàn)出白酒實(shí)際生產(chǎn)中真實(shí)的微生物代謝情況。因此，組合發(fā)酵方式成為研究白酒釀造微生物功能的有力工具[6-7]。本研究從濃香型白酒釀造環(huán)境中分離篩選了3 株酵母，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定后進(jìn)行了組合發(fā)酵特征研究，從微生物的角度解析了濃香型白酒中乙酸乙酯偏高的內(nèi)在原因，這為解決白酒行業(yè)中己乙比失調(diào)的問(wèn)題提供了新思路，有利于濃香型白酒的高質(zhì)量發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

微生物篩選樣品取自山東蘭陵美酒股份有限公司濃香型白酒生產(chǎn)車(chē)間大曲、釀酒工具、空氣，釀酒工具采用樣本無(wú)菌脫脂棉預(yù)濕法進(jìn)行采樣，空氣樣本采用無(wú)菌脫脂棉鼓風(fēng)附著法和自然沉降法采樣。采樣結(jié)束后將脫脂棉置于無(wú)菌自封袋中4 ℃冷藏儲(chǔ)存。

酵母篩選培養(yǎng)基選用WL 合成培養(yǎng)基，青島海博生物；青霉素，山東魯抗；酵母保藏培養(yǎng)基采用YPD 培養(yǎng)基；PCR 產(chǎn)物回收、純化、質(zhì)粒的提取等DNA 操作試劑盒購(gòu)自大連生物工程（大連）有限公司；酵母26S rDNA 序列鑒定委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行；酵母發(fā)酵糖液為10°Bx高粱汁培養(yǎng)基；淀粉酶和糖化酶購(gòu)自無(wú)錫雪梅。

儀器設(shè)備：美國(guó)伯樂(lè)PCR 儀，北京百晶電泳儀和凝膠成像分析儀，YXQ-LS-75SN 立式壓力蒸汽滅菌鍋，JHT-系列凈化工作臺(tái)，MJX-280S 智能霉菌培養(yǎng)箱，F(xiàn)LY-211C 恒溫振蕩培養(yǎng)箱，安捷倫7890A氣相色譜儀，上海譜元A-1502分光光度計(jì)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酵母的篩選

將采集的篩選樣品加入生理鹽水振蕩3 min，取上清液用無(wú)菌水將其稀釋至10-1～10-5等系列梯度，分別吸取200 μL 各樣本梯度稀釋菌液涂布于WL 合成培養(yǎng)基，30 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d 進(jìn)行初篩。然后選取不同菌落形態(tài)的酵母，采用平板劃線法進(jìn)行復(fù)篩。獲得酵母純培養(yǎng)后，接入YPD 培養(yǎng)基保藏備用。

1.2.2 酵母的分子生物學(xué)鑒定

以經(jīng)NaOH 破壁提取的酵母DNA 為模板[8]，以26S rDNA-D1/D2區(qū)域的通用引物為擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到酵母26S rDNA-D1/D2 區(qū)域的基因，經(jīng)純化后送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序。將酵母的26S rDNA-D1/D2 基因序列測(cè)序結(jié)果通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST 進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果用MEGA5.0 軟件進(jìn)行同源性分析，并采用鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 酵母生長(zhǎng)曲線的繪制

將酵母在無(wú)菌條件下接入YPD 液體培養(yǎng)基，30 ℃恒溫150 r/min 培養(yǎng)48 h，然后每隔一段時(shí)間取樣，以未接種酵母的液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，在600 nm 處測(cè)定其吸光度，測(cè)定值控制在0.1～0.9 之間。如果菌懸液太濃，可適當(dāng)稀釋。最后，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制酵母的生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 發(fā)酵醪微量組分分析

量取25 mL 發(fā)酵醪于250 mL 錐形瓶中，加入無(wú)水乙醇100 mL 浸提15 min，旋渦振蕩5 min。然后將浸提液用雙層紗布過(guò)濾至500 mL 燒杯中，并用100 mL 去離子水分?jǐn)?shù)次充分洗滌錐形瓶、燒杯、紗布，濾液與洗液全部倒入1000 mL 蒸餾瓶中，用100 mL 容量瓶接收餾出液（外用冰水?。徛訜嵴麴s，當(dāng)餾出液接近刻線時(shí)，取出容量瓶，調(diào)液溫20 ℃，用去離子水定容，混勻后用氣相色譜法[9]檢測(cè)微量組分。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌株的篩選及菌落形態(tài)

經(jīng)過(guò)分離純化和菌落形態(tài)的初步鑒定共獲得3株酵母，分別命名為J1、J2和J3，其菌落形態(tài)特征如表1 所示。由3 株酵母菌株的形態(tài)特征可以初步判定：篩選得到的酵母形態(tài)特征差別較大，種屬的分類(lèi)地位各不相同。

表1 濃香型白酒車(chē)間3株酵母菌株的菌落形態(tài)特征

2.2 酵母菌株的分子生物學(xué)鑒定

為了進(jìn)一步確定J1、J2、J3 的種屬地位，對(duì)其進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定。經(jīng)測(cè)序表明，研究中J1、J2、J3 獲得26S rDNA-D1/D2 部分片段大小分別為621 bp、606 bp、625 bp。通過(guò)BLAST同源序列比對(duì)表明J1、J2、J3 基因分別與Debaryomyces hansenii（GenBank:KC848298.1）、Pichia fermentans（Gen-Bank:KM589468.1）、Naumovozyma castellii（Gen-Bank:KY108659.1）同源性最高。利用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖1），結(jié)合3 株酵母的形態(tài)學(xué)特征對(duì)其做進(jìn)化樹(shù)聚類(lèi)分析，最終將J1、J2、J3 分別鑒定為漢斯德巴氏酵母菌（D.hansenii，Dh）、發(fā)酵畢赤酵母（P.fermentans，Pf）、卡斯特瑙曼氏酵母（N.castellii，Nc）。

圖1 采用鄰接法構(gòu)建3株酵母的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 酵母的生長(zhǎng)規(guī)律分析

采用分光光度法繪制3 株酵母的生長(zhǎng)曲線（圖2），結(jié)果表明：3 株酵母遲緩期差別不大，在培養(yǎng)48 h 后均能達(dá)到穩(wěn)定期；Dh 和Pf 生長(zhǎng)速度較快，穩(wěn)定期菌體濃度較大；Nc 生長(zhǎng)速度一般，穩(wěn)定期菌體濃度較低，進(jìn)入衰亡期時(shí)間較早。

圖2 3株酵母的生長(zhǎng)曲線

2.4 酵母的純種發(fā)酵規(guī)律分析

將培養(yǎng)好的Dh、Pf 和Nc 種子液按照1.0×105cfu/mL 接種于10 °Bx 高粱汁培養(yǎng)基中發(fā)酵，30 ℃恒溫靜置培養(yǎng)4 d 后得到3 株酵母的發(fā)酵醪微量組分。根據(jù)表2 可知，Pf 產(chǎn)乙酸乙酯能力明顯高于Dh 和Nc，Dh 產(chǎn)乙酸乙酯能力最低，Dh、Pf 和Nc產(chǎn)有機(jī)酸和醇類(lèi)物質(zhì)差別不明顯。

表2 3株酵母發(fā)酵醪中主要的微量組分對(duì)比

2.5 酵母的組合發(fā)酵規(guī)律解析

考慮到Pf 產(chǎn)乙酸乙酯與Dh、Nc 的差異性以及Dh、Pf 和Nc 生長(zhǎng)的規(guī)律性設(shè)計(jì)了如表3 所示的酵母組合發(fā)酵試驗(yàn)。表3 中1.0×105cfu/mL 為1 個(gè)比例單位，比如P10N 試驗(yàn)中Pf 的發(fā)酵起始濃度控制為1.0×106cfu/mL，其他組合亦然。

將培養(yǎng)好的Pf、Nc 和Dh 種子液按照表3 中的比例關(guān)系接種于10 °Bx 高粱汁培養(yǎng)基中發(fā)酵，30 ℃恒溫靜置培養(yǎng)，期間取樣分析酵母的群體生長(zhǎng)情況和發(fā)酵醪微量組分，結(jié)合圖3 和表4 得到了3株酵母的組合發(fā)酵規(guī)律。

表3 3株酵母的組合發(fā)酵試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在發(fā)酵初始階段（0～1 d），Pf 迅速生長(zhǎng)起來(lái)，乙酸和乙酸乙酯同步積累；根據(jù)PN、PD、PND 組合發(fā)酵結(jié)果來(lái)看Pf 生長(zhǎng)受Nc 和Dh 抑制明顯，進(jìn)而影響到初始階段乙酸和乙酸乙酯的積累（圖3d、圖3e、圖3g），其中PND 組合乙酸乙酯的初始合成量減少80.18%；增加Pf 接種量后乙酸乙酯積累量明顯增加，其中P100ND 組合乙酸乙酯的初始合成量是PND 組合的3.40 倍；另外，Nc 和Dh 在此階段也迅速生長(zhǎng)起來(lái)，結(jié)合3N、3D、ND 組發(fā)酵結(jié)果來(lái)看Nc和Dh的生長(zhǎng)此階段都受到了不同程度的抑制。發(fā)酵中期（1～3 d），Pf 繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖，乙酸和乙酸乙酯的變化趨勢(shì)出現(xiàn)差別；根據(jù)PN、PD、PND 組合發(fā)酵結(jié)果來(lái)看Nc 和Dh 對(duì)Pf 生長(zhǎng)的抑制作用逐漸減弱，乙酸乙酯積累持續(xù)增加（圖3d、圖3e、圖3g），其中PND 組合3 d 時(shí)乙酸乙酯的積累量與3P 組相當(dāng)（占3P 組79.86%），乙酸的積累受多種因素影響規(guī)律性不明顯；增加Pf 接種量后乙酸乙酯積累量增加明顯，其中P100ND 組合3 d 時(shí)乙酸乙酯的積累量是PND 組合的2.12 倍；另外根據(jù)3N、3D、ND組發(fā)酵結(jié)果來(lái)看，Dh生長(zhǎng)受Nc抑制很小。

圖3 3株酵母發(fā)酵醪中乙酸和乙酯乙酯的動(dòng)態(tài)變化

發(fā)酵后期（3～4 d），由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏等諸多不利因素Pf 生長(zhǎng)緩慢或進(jìn)入衰亡期，乙酸乙酯積累速度放緩，PN、P10N 和P100N 組合乙酸乙酯積累量增加明顯；根據(jù)PN、PD、PND 組合發(fā)酵結(jié)果來(lái)看Dh對(duì)Pf 后期積累乙酸乙酯影響明顯，Nc 對(duì)Pf 發(fā)酵后期影響較小，結(jié)合表4 群體生長(zhǎng)情況推斷Dh對(duì)Pf 發(fā)酵后期屬于代謝物抑制；增加Pf 接種量后P10ND 和P100ND 乙酸乙酯積累量增加較小，其中P100ND組合發(fā)酵后期乙酸乙酯的積累量?jī)H僅增加8.36 mg/L，Dh 對(duì)Pf 后期積累乙酸乙酯的抑制作用明顯。

表4 3株酵母發(fā)酵醪中群體生長(zhǎng)情況(×107 cfu/mL)

3 結(jié)論

3.1 通過(guò)26S rDNA-D1/D2 同源比對(duì)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)合形態(tài)學(xué)特征將濃香型白酒釀造環(huán)境中篩選出的3 株酵母鑒定為發(fā)酵畢赤酵母（P.fermentans）、卡斯特瑙曼氏酵母（N.castellii）和漢斯德巴氏酵母菌（D.hansenii）。

3.2 發(fā)酵畢赤酵母Pf是1株高產(chǎn)乙酸乙酯的酵母，漢斯德巴氏酵母菌Dh對(duì)Pf積累乙酸乙酯的抑制作用明顯高于卡斯特瑙曼氏酵母Nc 對(duì)Pf 的抑制作用，Dh 對(duì)Pf 發(fā)酵產(chǎn)乙酸乙酯屬于代謝物抑制；提高Pf接種量可以適當(dāng)提高乙酸乙酯的積累水平。

3.3 通過(guò)群體生長(zhǎng)情況發(fā)現(xiàn)Pf 和Dh 生長(zhǎng)受Nc 的抑制作用很小，Nc 生長(zhǎng)受Pf 和Dh 抑制作用明顯；結(jié)合酵母組合發(fā)酵確定了3 株酵母的種群關(guān)系，即Pf為優(yōu)勢(shì)種群，Dh次之，Nc為劣勢(shì)種群。

3.4 濃香型白酒中乙酸乙酯偏高的內(nèi)在原因是酵母的種群結(jié)構(gòu)失調(diào)，造成畢赤酵母等高產(chǎn)乙酸乙酯的酵母種屬大量增殖，該屬酵母具有較強(qiáng)的種群生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。

本研究從酵母組合發(fā)酵和種群關(guān)系的角度出發(fā)分析乙酸乙酯偏高的內(nèi)在原因，還未涉及到濃香型白酒生產(chǎn)和發(fā)酵過(guò)程中微生物種群結(jié)構(gòu)分析，有待于進(jìn)一步的研究。