大柴胡湯改善肝胃郁熱型T2DM及胰島β細胞功能 損害的研究

岑曦，張靜，王艷

(甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000)

0 引言

現代醫學認為，2型糖尿病(T2DM)即非胰島素依賴性糖尿病，在其發展的早期階段，胰島β細胞功能低下，開始出現胰島素分泌功能減退，“三多一少”的癥狀明顯，但無明顯心、腎、腦損傷[1]。T2DM 的誘發機制復雜，目前一般認為，T2DM 的病理生理機制主要包括β細胞功能障礙和胰島素抵抗(IR) 兩個方面[2]，胰島β細胞數量的逐步減少和功能的損害是早期T2DM發生的重要標志[3]。目前，已證實糖毒性、脂毒性、炎癥、胰島淀粉樣多肽過多沉積、氧化應激均會對胰島β細胞造成損害，會導致胰島β細胞的功能嚴重障礙[4-6]。網絡藥理學研究表明，大柴胡湯在調節胰島素分泌、參與葡萄糖跨膜轉運等生物過程中起到重要作用，且在胰島素抵抗通路上富集的靶點最多[7]。嚴學森[8]認為具有內泄熱結，和解少陽功效的大柴胡湯治療消渴，可滌蕩郁滯，通利氣機；王國斌[9]認為由于飲食、情志等因素導致的肝失疏泄在消渴中占重要地位。仝小林[10]認為消渴分為“郁、熱、虛、損”四大階段，在郁熱階段，胃納太過、脾運不及、肝木郁結，且熱象逐漸明顯。故研究大柴胡湯對早期肝胃郁熱型T2DM的治療效果為對象，采用SD大鼠，通過觀察一般情況、FBG、FINS、血清C肽、HOMAIR、HOMA-β、血脂六項的變化，從而證明大柴胡湯具有增加胰島β細胞數量、改善胰島β細胞和IR的作用，對于T2DM早期治療、延緩和防止進階病變有重要的意義。

1 材料及方法

1.1 實驗動物

健康CV級雄性SD大鼠60只，體重(200±20)g，由中國農業科學院蘭州獸醫研究所提供，實驗動物許可證號：SCXK(甘)2015-0001。室溫20℃～25℃，濕度50%～65%，每日光照正常，空氣流通，自由攝食、飲水。

1.2 藥物

大柴胡湯：《金匱要略》中，柴胡半斤，黃芩三兩，芍藥三兩，半夏半升(洗)，生姜五兩(切)，枳實四枚(炙)，大棗12枚(擘)，大黃二兩。根據國家劑量總局編《中國古代度量衡圖集》記載漢代一兩為15.6g，又據人(60kg)和動物(200±20)g間按體表面積折算的等效劑量比值表換算得出：柴胡26.8g，黃芩10g，大黃6.8g，枳實4.5g，白芍10g，法半夏8.3g，大棗5.2g，生姜16.8g。藥物購于甘肅中醫藥大學附屬醫院，煎煮濃縮至1g/mL；鹽酸二甲雙胍腸溶片(貴州天安藥業股份有限公司，規格：0.25g/片，國藥準字：20160646)。

1.3 主要試劑及儀器

高脂高糖飼料、普通大小鼠維持飼料(北京科澳協力飼料有限公司，許可證號：SCXK(京)2014-0010)；鏈脲佐菌素(STZ)(北京索來寶生物科技有限公司)；胰島素測定試劑盒(北京華英生物技術研究所，生產批號：20170805)；大鼠C肽ELISA試劑盒(產品貨號：MM-0588R1)；總膽固醇試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，執行標準號：YZB/國 2084-2003)；甘油三酯試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，執行標準號：YZB/國 2087-2003)；直接低密度脂蛋白膽固醇試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，執行標準號：YZB/國 0599-2003)；直接高密度脂蛋白膽固醇試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，執行標準號：YZB/國 0677-2003)；游離脂肪酸微量測定試劑盒(北京華英生物技術研究所，生產批號：20170701)；安穩血糖儀配套血糖試紙(三諾生物傳感股份有限公司，生產批號：2629EN)；A6半自動生化儀(北京松上技術有限公司)；華衛德朗DR-200BS酶標分析儀(無錫華衛德朗儀器有限公司)。

1.4 動物分組及處理

采用隨機數字表法將大鼠分為空白組(10只)和造模組(50只)，空白組常規飼料喂養，造模組大鼠高糖高脂飼料喂養的同時，進行合籠飼養(同組的2籠大鼠合于1籠，每次持續12h)、禁食(不禁水，每次持續12h)、禁水(不禁食，每次持續12h)，以上三項每天隨機安排一種[11]，持續4周后，大鼠禁食不禁水12h，稱重，造模組大鼠分三次腹腔內注射 STZ(20mg /kg，溶于0.1mmol /L 檸檬酸緩沖液，pH 4.5，終濃度為1%，冰浴，現配現用，20min內用完)，空白組大鼠注射等量0.9%氯化鈉溶液。72h后，造模組大鼠出現情緒暴躁的表現，毛發豎起，多飲、多食、多尿癥狀，進行尾靜脈采血，血糖≥16.7mmol /L，則肝胃郁熱型T2DM 模型成功[12]。

造模過程中，空白組死亡1只，剩余9只。造模組死亡18只，剩余32只。造模成功大鼠隨機分為模型組(n=7)、西藥組(n=7)、HCM組(n=6)、MCM組(n=6)、LCM組(n=6)。空白組給予常規飼料喂養，其余各組給予高糖高脂飼料以維持。西藥組給予二甲雙胍1.5g·kg-1灌胃，HCM、MCM、LCM組分別給予大柴胡湯水煎液3.38g·kg-1，1.13g·kg-1，0.38g·kg-1灌胃，空白組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，各組大鼠均自由飲水，共灌胃4周。

1.5 觀察指標及方法

樣本制備給藥4周后，大鼠禁食不禁水12～14h后檢測空腹血糖(FBG)并稱重，以水合氯醛(30mg/kg)腹腔麻醉，大鼠仰臥位固定，局部消毒后沿腹正中線打開腹腔，經腹主動脈取血10mL，12000r/分離心10min，分離血清，置-20℃冰箱保存；分離胰腺周圍脂肪并取出胰腺，將胰腺標本置于4%中性甲醛固定液，用于HE染色觀察病理形態。

一般情況觀察大鼠精神狀態、飲食及活動情況、毛色、飲水量、尿量等；并分別于給藥前后提大鼠尾部促使其排空尿液測量體重。

空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)及血清C肽檢測采用安穩血糖儀檢測，簡述方法(取血位置、方法等)。采用酶聯免疫法檢測FINS、血清C肽：取出4℃放置的試劑盒于室溫0.5h，取濃縮洗滌液，根據當批檢測數量，用蒸餾水1∶20稀釋，混勻后備用；校準品S1～S5及質控品，第一次使用前先用0.5mL蒸餾水溶解后充分搖勻，放置10min后使用；將預包被板從密封袋中取出，設一個空白對照孔，不加入任何液體，每個校準點一次各設兩孔，每孔加入相應校準品50 μL，其余每個檢測孔直接加質控品或帶測血清50μL，然后各孔加入酶標抗體50μL，充分混勻，貼上封板膜，置37℃溫育1h；棄去孔內液體，洗滌液注滿各孔，靜置10s甩干，重復3次后拍干；每孔加顯色劑A液50μL，顯色劑B液50μL，振蕩混勻后，置37℃避光顯色15min，每孔加終止液50μL；在15min內在450nm波長測各孔吸光度A；制作標準曲線，計算各樣本濃度。胰島素抵抗指數及分泌指數的計算：根據FBG和FINS計算胰島素抵抗指數(HOMA-IR)和胰島素分泌指數(HOMA-β)。計算公式：HOMA-IR= FBG×FINS/22.5；HOMA-β= 20×FINS/(FBG-3.5)。

半自動生化儀取XX微升樣本，使用比色法檢測總膽固醇(TC)，甘油三酯(TG)，糖化血紅蛋白(HbA1c)，游離脂肪酸(FFA)，直接低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，直接高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)，數據以XX表示。

HE染色將固定液中的胰腺組織進行酒精脫水及二甲苯透明；用石蠟進行浸蠟，包埋后切片，展片，烤片；使用二甲苯脫蠟，酒精至水；再使用蘇木精水溶液，酒精伊紅染色液染色；脫水、透明后封片。進行鏡下觀察。

1.6 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件包進行數據統計分析，實驗結果以(±s)表示，各組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD方法，以P<0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠FBG水平和體重比較

與空白組相比，模型組體重下降，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組相比，西藥組FBG下降、體重顯著降低，LCM、MCM組體重減輕，HCM組體重顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與西藥組相比，LCM組FBG下降，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠FBG水平、體重比較(±s)

表1 各組大鼠FBG水平、體重比較(±s)

注：FBG，空腹血糖；與空白組比較，*P<0. 05，**P<0.01；與模型組比較△P<0.05，△△P<0.01；與西藥組比較，▲P<0.05(下同)。

組別 例數 FBG(mmol/L) 體重(g)空白組 9 4.85±0.59 295.5±11,24模型組 7 19.18±1.24 272.9±13.5**西藥組 7 7.95±2.90△ 214.9±23.4△△LCM組 6 6.83±2.97▲ 246.2±23.4△▲MCM組 6 6.48±2.89 245±17.2△▲HCM組 6 10.02±1.02▲ 232.3±28.8△△

2.2 各組大鼠FINS、HOMA-IR、HOMA-β、C肽水平比較

與空白組相比，模型組FINS下降，差異有統計學意義(P<0.05)，HOMA-β和C肽顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組相比，MCM、HCM組FINS升高，MCM組HOMA-IR顯著降低，HCM組HOMA-β顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，各治療組C肽變化不明顯，差異無統計學意義(P>0.05)；與西藥組相比，MCM組FINS升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠FINS、HOMA-IR、HOMA-β、C肽水平比較(±s)

表2 各組大鼠FINS、HOMA-IR、HOMA-β、C肽水平比較(±s)

注：C-Peptide，c肽；FINS，空腹胰島素；HOMA-IR，胰島素抵抗指數；HOMA-β，胰島素分泌指數。

組別 例數 FINS(mIU/L) HOMA-IR HOMA-β Peptide(ng/mL)空白組 9 14.03±3.02 3.08±1.06 209.56±35.67 0.13±0.00模型組 7 6.15±1.21* 5.28±1.35 7.8±1.07** 0.13±0.00西藥組 7 6.41±1.35 2.28±0.97△ 66.83±56.8 0.13±0.00 LCM組 6 2.8±3.54 1.17±1.82 18.26±11.43 0.13±0.00 MCM組 6 8.11±0.7△▲ 2.38±1.17△△ 124.97±110.44 0.13±0.00 HCM組 6 11.41±3.43△ 5.15±1.85▲ 34.81±7.85△△ 0.13±0.00

2.3 各 組 大 鼠HDL-C、LDL-C、TC、TG、FFA、HbA1c水平比較

與模型組相比，西藥組TC顯著降低、TG降低，與西藥組相比，LCM組TG降低,差異均有統計學意義(P<0.05)；兩組HDL-C、LDL-C、FFA與HbAlc比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組大鼠HDL-C、LDL-C、TC、TG、FFA、HbA1c水平比較(±s)

表3 各組大鼠HDL-C、LDL-C、TC、TG、FFA、HbA1c水平比較(±s)

注：HDL-C，直接高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C，直接低密度脂蛋白膽固醇；TC，血清總膽固醇；TG，甘油三酯；FFA，游離脂肪酸；HbA1c，糖化血紅蛋白。

組別 例數 HDL-C LDL-C TC TG FFA HbA1c空白組 9 0.43±0.38 0.81±0.07 6.68±2.7 2.78±1.71 0.7±0.15 9.2±1模型組 7 0.74±0.26 2.43±1.79 6.87±1.75▲ 2.74±0.59▲ 0.51±0.03 6.7±0.29西藥組 7 0.62±0.48 0.76±0.22 6.76±2.28△△ 2.52±1.6△ 0.57±0.10 8.31±0.46 LCM組 6 0.5±0.36 0.74±0.07 6.71±2.7 2.85±1.2▲ 0.46±0.07 7.8±0.55 MCM組 6 0.7±0.12 0.89±0.03 4.24±1.03 1.67±0.3 0.33±0.08 5.2±0.29 HCM組 6 0.95±0.27 1.22±0.28 4.71±1.59 2.1±0.47 0.39±0.03 6.34±0.4

2.4 各組大鼠HE染色胰腺病理形態比較

空白組有大量正常胰島分布，胰腺小葉組織結構清晰，腺泡小葉完整，偶見炎性細胞浸潤。模型組僅見少量殘存的纖維化胰島，胰腺小葉輪廓破壞，大面積出血壞死，間質水腫，大量炎性細胞浸潤。西藥組胰腺組織內胰島赫外分泌腺中只有少量淋巴細胞浸潤，散在新生胰島，胰島數目較模型組有所增加，少量炎性細胞浸潤。中藥組較模型組病變有明顯改善，MCM組最為明顯，除可見少量炎性細胞浸潤外，未見其他明顯病理改變，見圖1。

圖1 各組大鼠HE染色病理形態比較 40×10

3 討論

T2DM的發病機制主要為胰島素抵抗(IR)及β細胞功能受損，這兩方面也可用來預測肥胖及糖耐量不足的病人患T2DM的高風險，且在兒童和青少年群體中，T2DM發病率持續上升[13]。由此，從糖尿病發病前期以及糖尿病家系的非糖尿病一級親屬等高危人群，到糖尿病進展過程中，β細胞功能受損普遍存在。普遍觀點認為，在T2DM發展過程中，隨著IR的持續存在，β細胞功能會發生進行性喪失，反過來也會導致IR加重，而近幾年研究發現，胰島素過度分泌可能先于IR發生，胰島素分泌時間會提前并且延長，促進IR[14]，故盡早干預以保護β細胞功能、改善IR成為治療T2DM的關鍵。目前研究T2DM的方式是將基因組學、蛋白質組學、代謝組學相互聯合，動態地，多角度地，整體地分析其病理變化[15-17]，而中醫治療的特點與上述研究方式契合：中藥由許多復合成分組成，作用的機理往往是多途徑、多因素、多環節的[18]；同時，需通過降糖、降脂、糾正代謝紊亂等綜合因素來改善IR及β細胞功能障礙的治療指導原則也符合中醫整體觀診療思維。

消渴病早期的演變在《素問·奇病論》中提及：“此五氣之溢也，名曰脾癉。夫五味入口，藏于胃，脾為之行其精氣，津液在脾，故令人口甘也。此肥美之所發也，此人必數食甘美而多肥也，肥者令人內熱，甘者令人中滿，故其氣上溢，轉為消渴，治之以蘭，除陳氣也。”此時胃納太過，脾運不及，適用于大柴胡湯滌蕩郁滯，通利氣機；同時，《靈樞·五變篇》最早認識到肝與消渴病的聯系：“怒則氣上逆，胸中畜積，血氣逆留……轉而為熱，熱則消肌膚，故為消癉”因此，在消渴病早期，過食肥甘、中滿內熱、情志不暢導致的脾胃氣機失調、肝氣郁滯是其主要病機，符合肝胃郁熱型T2DM的特征。仝小林[19]認為，肝胃郁熱是T2DM郁熱階段的主要病機，取大柴胡湯和解少陽、內瀉熱結的功效，用開郁清熱法治療肝胃郁熱型T2DM早期，療效肯定，降糖效果明顯。就目前治療現狀來看，中醫藥在治療DM方面具有一定的優勢，故研究古方的廣泛應用及其作用機制具有重要意義。

大柴胡湯源于《傷寒論》和《金匱要略》，據考察，漢代一兩折合15.6g是符合度量衡沿革史實及科學考證的，較貼近仲景劑量原貌[20]，故大柴胡湯的經方劑量遠遠超于現代臨床用量。此方配伍嚴謹，方中重用柴胡為君藥，配臣藥黃芩和解清熱，以除少陽之邪；輕用大黃配枳實以內瀉陽明熱結，行氣消痞，亦為臣藥。芍藥柔肝緩急止痛，與大黃相配可治腹中實痛，與枳實相伍可以理氣和血，以除心下滿痛；半夏和胃降逆，配伍大量生姜，以治嘔逆不止，共為佐藥。大棗與生姜相配，能和營衛而行津液，并調和脾胃，功兼佐使。總之，本方既不悖于少陽禁下的原則，又可和解少陽，內瀉熱結，使少陽與陽明合病得以雙解，可謂一舉兩得。然而大柴胡湯作為經方，本應藥少而精，藥專力宏，臨床用方卻藥味繁多，劑量偏小，與經方治療危、難、重證的效果相差甚遠。本篇論點為早期T2DM是由于郁熱內結，應從肝胃論治，主要在肝[21]。此經方中各藥物嚴密配伍，各司其職，缺一不可，加味有余，共奏解少陽泄陽明之效，而經方用于臨床，必須注重回歸原方劑量，才能提高臨床療效，對于T2DM早期治療、延緩和防止進階病變有重要的意義。

本實驗結果提示：①大柴胡湯可降低糖尿病初期大鼠的體重和FBG，改善肝胃郁熱癥狀，減慢“三多一少”癥狀出現的速度；HOMA-IR水平降低，則說明該方改善IR有效；FINS、HOMA-β升高，胰島細胞數目增加，說明該方可恢復胰島β細胞功能。綜上，大柴胡湯可減緩早期糖尿病的進行性發展。②中藥中劑量組，也就是大柴胡湯原方改善各項指標的作用較為明顯，從而證明古方治療肝胃郁熱型T2DM及改善胰島β細胞功能具有重要的意義，值得開展進一步的機制研究。存在問題：血脂六項以及血清C肽的變化不顯著，可能是由于大柴胡湯降血脂需要一個長期的過程，C肽的水平也需要長期的疾病過程來體現顯著的差異，短期的造模時間未能完全體現。創新性：突出現代臨床用藥劑量與經方劑量的差別所在，強調回歸原始經方劑量，將其用于實驗、指導臨床，從而切實提高療效的重要性，值得進一步探討。