透明化三維成像研究艾灸對結腸炎大鼠腸道血管生成的作用

祁琴,童小雨,吳璐一,吳楚婷,趙繼夢,黃艷,李昆珊,馬曉芃,王照欽,馮異,吳煥淦

·動物實驗·

透明化三維成像研究艾灸對結腸炎大鼠腸道血管生成的作用

祁琴1,童小雨2,吳璐一1,吳楚婷3,趙繼夢3,黃艷1,李昆珊3,馬曉芃3,王照欽1,馮異2,吳煥淦3

(1.上海中醫藥大學針灸免疫效應重點研究室,上海 200030;2.復旦大學基礎醫學院中西醫結合學系,醫學神經生物學國家重點實驗室,復旦大學中西醫結合研究院,上海 200032;3.上海市針灸經絡研究所,上海 200030)

應用組織透明化技術觀察隔藥灸對2-4-6三硝基苯磺酸(TNBS)誘導的實驗性結腸炎大鼠腸道血管生成的影響,從三維水平探討隔藥灸治療結腸炎的潛在機制。采用TNBS灌腸法制備結腸炎大鼠模型,將大鼠隨機分為正常組、模型組、隔藥灸組和抑制劑組,每組8只。隔藥灸組采用隔藥灸天樞、氣海穴治療;抑制劑組采用10 mg/mL的血管內皮細胞生長因子受體(VEGFR)抑制劑溶液按1 mL/kg體質量進行腹腔注射治療。采用蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察各組結腸組織病理學改變;采用CUBIC組織透明化技術對各組大鼠結腸組織進行透明化處理,通過血小板內皮細胞黏附分子1(PECAM-1/CD31)染色標記血小板內皮細胞,采用Imaris三維圖像處理軟件對結腸血管網絡進行三維測量和分析。HE染色結果顯示,模型組大鼠結腸形態結構紊亂,黏膜固有層有明顯裂隙樣潰瘍,并有大量炎性細胞浸潤;隔藥灸組和抑制劑組上述病理改變均減輕,可見新生的黏膜上皮修復。結腸血管網絡三維測量和分析結果顯示,與正常組比較,模型組結腸組織病理學評分顯著升高,結腸平均血管密度增加,分支等級增加,血管直徑降低;與模型組比較,隔藥灸組和抑制劑組結腸組織病理學評分均顯著降低,結腸平均血管密度降低,分支等級降低,血管直徑增加,而隔藥灸組和抑制劑組無明顯差異。隔藥灸能有效減輕結腸炎大鼠結腸炎癥和組織損傷,抑制結腸炎大鼠結腸血管生成,從而發揮對結腸炎的治療作用。

針灸療法;結腸炎;藥餅灸療法;組織透明化;血管生成;三維成像;2-4-6三硝基苯磺酸;大鼠

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)包括潰瘍性結腸炎和克羅恩病,是一類非特異性的慢性腸道炎性疾病,臨床表現多為腹痛、腹瀉、便血等。本病較難徹底根治,多數患者呈終生反復發作,具有潛在的癌變風險[1]。近年來,國內IBD發病率逐年攀升,但其具體發病機制尚未完全闡明[2]。有研究通過對IBD患者結腸黏膜血小板內皮細胞黏附分子1(platelet endothelial cell adhesion molecule 1, PECAM-1/CD31)免疫組化染色發現IBD患者結腸黏膜和黏膜下層的血管密度明顯高于健康人[3]。組織透明化三維成像技術能從組織器官的宏觀層面研究血管結構,完整且準確地反映機體在生理、病理狀態下血管生成的細微變化。故本研究采用2-4-6三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS)建立實驗性結腸炎大鼠模型,應用組織透明化技術,從三維宏觀角度觀察血管生成在結腸炎發病中的作用并探討隔藥灸對結腸炎大鼠腸道血管生成的影響,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

36只清潔級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司[實驗動物生產許可證號SCXK(滬)2017-0005],體質量為(170±10)g,飼養于上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院科研處實驗動物中心[實驗動物使用許可證號SCXK(滬)2018-0040]。

1.2 主要試劑與儀器

5%(W/V)TNBS(Sigma,美國);阿西替尼(博飛美科,中國);二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)(上海碧云天生物技術有限公司,中國);藥粉(上海華濟藥業有限公司,中國);艾絨(南陽漢醫艾絨有限責任公司,中國);黃酒(上海慶豐釀造調味品有限公司,中國);多聚甲醛(上海國藥集團有限公司,中國);戊巴比妥鈉(Sigma,美國);伊紅染色液(上海生工生物工程股份有限公司,中國);蘇木素染色液(上海生工生物工程股份有限公司,中國);PI(Sigma,美國);山羊抗鼠CD31抗體(R&D Systems,美國);驢抗山羊IgG(Abcam,英國);雙光子共聚焦顯微鏡(Nikon,日本);光片顯微鏡(锘海LS18,中國);光學顯微鏡(Olympus,日本)。

組織透明液具體制作步驟為,將25 g尿素、24.96 g四乙二胺、28.8 g蒸餾水放置在100 mL離心管中攪拌均勻,待完全溶解降至室溫之后加入5 g Triton X-100,最后靜置過夜或置于真空泵(0.1 MPa)中30 min脫氣去除氣泡。

1.3 造模方法

將36只雄性SD大鼠隨機分為正常組10只和造模組26只。正常組大鼠不進行任何處理,造模組大鼠采用TNBS灌腸液制備結腸炎大鼠模型[4]。具體造模步驟為,采用2%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)的劑量對大鼠進行腹腔注射麻醉,將5%TNBS與50%乙醇按2:1體積比混合均勻配制成TNBS灌腸液,每次灌腸劑量為3 mL/kg。每周灌腸1次,共4次。造模結束后,正常組和造模組各隨機抽取2只大鼠,對其結腸組織進行蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色觀察來鑒定模型是否制備成功。

1.4 分組與治療

造模組大鼠造模成功后,隨機分為模型組、隔藥灸組和抑制劑組,每組8只,并與正常組大鼠作對照。

正常組和模型組大鼠不進行處理。

隔藥灸組選取天樞(雙)、氣海穴進行隔藥餅灸。先將附子、肉桂、丹參等藥研末,用黃酒調和之后制成厚約0.3 cm、直徑約0.5 cm的藥餅,將重約90 mg的艾絨捏成艾炷后放在藥餅上,再置于相應穴位上施灸。每次每穴灸2壯,每日1次,連續治療7 d。

抑制劑組采用血管內皮細胞生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)抑制劑(阿西替尼)灌胃治療。將VEGFR抑制劑粉末與DMSO、生理鹽水配制成10 mg/mL的溶液,按1 mL/kg體質量進行灌胃。每日1次,連續治療7 d。

1.5 標本采集

治療結束后,各組均采用2%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)行腹腔注射麻醉,先以4%多聚甲醛溶液灌流固定,然后用4%多聚甲醛溶液緩慢灌注至四肢、尾部僵硬,取肛門向上6～8 cm的結腸,分為兩部分放入4%多聚甲醛溶液中固定,一部分用于結腸組織病理學觀察,另一部分用于組織透明化。

1.6 大鼠結腸組織病理學觀察

經4%多聚甲醛固定24 h后的結腸組織通過石蠟切片、HE染色,在光學顯微鏡下觀察各組結腸組織形態,并根據結腸組織病理學評分標準進行評分[5]。每只大鼠的結腸組織病理學評分為炎癥程度評分、損傷程度評分、隱窩損傷評分和病變范圍評分之和,評分范圍為0～14分。詳見表1。

表1 大鼠結腸組織病理學評分標準

1.7 CUBIC透明化三維成像

采用以脫脂為主要原理的CUBIC透明化方法對各組大鼠結腸組織進行透明化處理,主要包括組織透明、免疫熒光染色、折射率匹配、顯微鏡成像和三維數據處理。結腸組織在4%多聚甲醛中4 ℃過夜固定,在室溫下采用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)清洗固定的組織,再用約10 mL的組織透明液在37 ℃搖床上搖晃浸泡至透明,再用PBS室溫洗脫透明液3次,每次2 h。用含5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)的PBS溶液按照1:100的稀釋比例配制一抗溶液(CD31),37 ℃恒溫孵育2 d;用PBS溶液清洗去除一抗溶液,37 ℃恒溫搖床清洗1 d;在避光條件下用含5% BSA的PBS溶液按照1:100的稀釋比例配制二抗溶液,37 ℃恒溫避光孵育2 d;用PBS溶液清洗去除二抗溶液,37 ℃恒溫搖床避光清洗1 d。結腸組織采用血小板內皮細胞黏附分子1(platelet endothelial cell adhesion molecule 1, PECAM-1/CD31)染色標記后,進行折射率匹配,即可光片顯微鏡成像。顯微鏡獲取的原始數據通過LS18 ImageCombine軟件[锘海生物科學儀器(上海)股份有限公司]數據轉換后借助Imaris三維圖像處理軟件進行處理。通過軟件分析功能“surface”“filament”半自動重構血管線狀結構,待相關操作完成后即可查看重構后結腸血管測量值,包括平均血管密度、分支級數和直徑等。

1.8 統計學方法

采用SPSS21.0統計軟件進行數據統計分析,若服從正態分布且方差齊時,組間比較采用方差分析()中的最小顯著性差異();方差不齊時,組間比較采用-,結果均采用均數±標準差表示。若不服從正態分布,則采用非參數檢驗中的秩和檢驗,結果采用中位數和四分位數間距[(25,75)]表示。以＜0.05表示差異具有統計學意義

2 結果

2.1 大鼠結腸組織病理學觀察

光學顯微鏡顯示,正常組大鼠結腸黏膜上皮組織結構完整,腺體排列規則,無潰瘍及炎性細胞浸潤等病理改變。模型組大鼠結腸損傷嚴重,黏膜上皮組織缺失,腺體排列紊亂,結腸黏膜充血水腫,可見大量炎性細胞浸潤以及潰瘍,多累及黏膜、黏膜下層,嚴重者深達肌層,呈裂隙樣改變,部分大鼠可見隱窩輕度或中度損傷。隔藥灸組大鼠結腸組織損傷明顯改善,結腸黏膜結構尚完整,腺體排列較規則,炎性細胞浸潤程度較模型組顯著減輕,并可見新生的黏膜上皮修復。抑制劑組大鼠結腸組織損傷程度也較模型組明顯減輕,腸上皮結構尚完整,腺體結構基本正常,潰瘍有愈合傾向,炎性細胞浸潤程度較模型組減少,黏膜下層可見少量充血,可見新生的黏膜上皮修復。詳見圖1。

由表2可見,與正常組比較,模型組結腸組織病理學評分顯著升高,差異有統計學意義(＜0.01)。與模型組比較,隔藥灸組和抑制劑組結腸組織病理學評分均顯著降低,差異均有統計學意義(均＜0.01);隔藥灸組和抑制劑組結腸組織病理學評分比較,差異無統計學意義(＞0.05)。

表2 各組大鼠結腸組織病理學評分比較 [M(P25,P75),分]

注:與正常組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01

圖1 各組大鼠結腸組織HE染色(×200)

2.2 大鼠結腸組織透明過程

由圖2可見,在心臟灌注后取出結腸組織,首先用4%多聚甲醛固定1 d后,結腸組織呈不透明的淡黃色。在經過透明液浸泡1周及折射率匹配液處理后,結腸組織呈完全透明狀態即可光片顯微鏡成像,整個結腸組織透明過程歷時8 d。待組織完全透明之后截取其中一部分進行后續免疫熒光染色和三維圖像分析。

圖2 使用CUBIC組織透明的過程示意圖

2.3 大鼠結腸組織血管網絡三維重構分析

免疫熒光染色用PI標記細胞核,CD31標記結腸組織的血管內皮細胞,可以完整重構結腸組織血管網絡。由圖3可見,模型組大鼠結腸血管網較正常組明顯密集,分支血管走行凌亂且數量增多;隔藥灸組和抑制劑組大鼠結腸血管網密集程度和血管分支數目均較模型組降低,分支血管走行凌亂程度也較模型組顯著降低,而隔藥灸組和抑制劑組之間無明顯差異。

通過Imaris軟件對結腸內部血管進行“Crop”截取并對血管部位進行放大,隨機選取其中5個不同部位進行平均血管密度、分支等級和血管直徑統計和分析。由表3可見,與正常組比較,模型組大鼠結腸組織平均血管密度顯著升高,差異有統計學意義(＜0.01);與模型組比較,隔藥灸組和抑制劑組結腸組織平均血管密度均顯著降低,差異均有統計學意義(＜0.05);隔藥灸組和抑制劑組結腸組織平均血管密度比較,差異無統計學意義(＞0.05)

注:藍色為PI標記細胞核,紅色為CD31血管內皮細胞染色顯示血管;第一行為原始三維重構,第二行為surface分析,第三行

表3 各組大鼠結腸組織平均血管密度比較 [M(P25,P75)]

注:與正常組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.05

由表4可見,與正常組比較,模型組大鼠結腸組織平均血管分支等級顯著升高,差異有統計學意義(＜0.01);與模型組比較,隔藥灸組和抑制劑組結腸平均血管分支等級顯著降低,差異均有統計學意義(＜0.01);隔藥灸組和抑制劑組結腸組織平均血管分支等級比較,差異無統計學意義(＞0.05)。

表4 各組大鼠結腸組織平均血管分支等級比較 [M(P25,P75)]

注:與正常組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01

由表5可見,與正常組比較,模型組大鼠結腸組織平均血管直徑顯著降低,差異有統計學意義(＜0.01);與模型組比較,隔藥灸組和抑制劑組結腸組織平均血管直徑均顯著升高,差異均有統計學意義(＜0.01,＜0.05);隔藥灸組和抑制劑組結腸組織平均血管直徑比較,差異無統計學意義(＞0.05)。

表5 各組大鼠結腸組織平均血管直徑比較[M(P25,P75), mm]

注:與正常組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01,3)＜0.05

3 討論

2-4-6三硝基苯磺酸可誘發大鼠腸道免疫反應,其誘導的大鼠結腸炎模型具有體質量減輕、腹瀉、結腸組織病理學改變等特點,與人類IBD發病機制和病理特點具有很大的相似性,是研究IBD較為廣泛的一種動物模型[6]。目前,TNBS誘導的實驗性結腸炎模型被廣泛應用于IBD發病機制研究、新型藥物作用靶點的研發實驗中[7-8]。本研究使用5%TNBS和50%乙醇溶液誘導大鼠結腸炎模型,誘導4周后大鼠結腸出現腺體破壞、大量炎性細胞浸潤,并有充血水腫、潰瘍,潰瘍呈裂隙樣改變,結腸組織受損明顯,以上結果說明本實驗所采用TNBS誘導大鼠實驗性結腸炎模型造模成功。

近年來,中醫藥尤其是針灸在治療IBD方面優勢明顯,得到了越來越多的關注和認可。國內外臨床研究表明,針灸治療IBD具有良好的臨床療效,可有效改善IBD患者腸道炎癥,降低疾病活動指數,同時還能明顯改善患者生活質量和總體幸福感[9-11]。艾灸作為中醫學的重要組成部分,可從多環節、多靶點調節機體生理平衡,且具有安全性高、復發率低及遠期療效好等優勢,在治療IBD的臨床中具有廣泛的應用前景[12-14]。大量研究也表明,艾灸可以通過調節基因表達、調控相關炎癥因子水平等,起到降低腸道炎癥反應、保護腸黏膜屏障、糾正腸道菌群失調、減輕結腸組織纖維化等作用,從而達到治療IBD的目的[15-17]。

組織器官三維結構信息的獲取長久以來均為生物學領域的研究重點之一。隨著共聚焦顯微鏡的研發和大數據采集處理系統以及計算機重建技術的不斷發展與優化,組織器官成像由傳統的二維組織切片發展到三維成像技術[18],其中具有成像深度高等優點的組織透明化技術可從組織器官的宏觀層面研究神經、脈管系統、蛋白質、核酸等結構,能完整準確地反映機體生理、病理狀態下組織器官結構的細微變化,將人們帶入了完整組織器官成像的全新領域。現代許多臨床研究表明艾灸在改善結腸炎患者臨床癥狀、控制病情活動、維持緩解方面具有較好的療效[19-20],而組織透明化技術能從宏觀和微觀角度觀察組織整體結構,與針灸的整體調節特點相契合。有研究采用組織透明化技術通過三維成像揭示卵巢的卵泡結構和血管系統的動態變化,并發現電針能夠促進多囊卵巢綜合征大鼠有腔卵泡血管生成和卵巢門附近血管神經支配,進而促進卵泡成熟、排卵和黃體的形成,從而恢復其病理生理[21-23]。除了提供平臺來研究血管新生在卵巢疾病中的作用外,通過組織透明化技術還可以從整體組織器官水平研究針灸對其他優勢病種的效應機理,如從整體水平觀察IBD的腸道、帕金森病的神經系統等,為腸道等組織高分辨率三維結構和生物功能等研究提供了有利的技術支持。

本研究采用組織透明化技術研究隔藥灸對結腸炎大鼠血管生成的作用,結果發現隔藥灸治療可改善TNBS誘導的結腸炎大鼠模型組織病理學改變,對大鼠結腸炎具有較好的治療效果,其作用機制可能與抑制結腸血管生成有關。血管生成是IBD發病機制的重要組成部分,其主要包括內皮細胞的刺激,基底膜和細胞外基質的降解,血管內皮細胞的增殖、遷移和粘附,重建形成新的血管和血管網[24]。慢性炎癥和血管生成是兩個密切相關的過程。缺氧時,巨噬細胞和其他炎癥細胞遷移到缺氧區,分泌多種血管生成因子,刺激內皮細胞,激活血管生成的初始環節。反之,血管生成又可通過白細胞遷移、攜帶氧氣、細胞因子和黏附分子等來增強機體炎癥反應[25],并在IBD腸道炎癥反應中發揮重要作用。血管生成由促血管生成因子及其配體協調完成,其中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是最主要的血管生成因子,它們與3種特異性受體(VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3)結合在IBD的發病中起著重要作用。有研究發現,在結腸炎患者的結腸中,黏膜微血管密度顯著高于健康人,腸道炎癥病灶中VEGF水平也顯著升高[26]。本研究中模型組大鼠結腸血管網變密集,分支血管走行凌亂且數量增多,其血管密度顯著高于正常組大鼠,與以往研究類似。

IBD患者腸道血管結構改變和重構是由于體內VEGF高表達,抗血管生成治療可減輕炎癥活動程度。目前,越來越多的研究表明抗血管生成成為治療IBD的重要環節,VEGF在結腸炎中可誘發病理學血管生成,增加微血管密度,導致血管收縮、微血栓形成,同時提高血管通透性、加重炎癥細胞浸潤[27]。而抗血管生成藥能夠通過靶向降低VEFG的表達來抑制IBD患者血管生成[28]。本研究中隔藥灸組和VEFGR抑制劑組大鼠結腸血管網密集程度和血管分支數目均降低,分支血管走行凌亂程度也較模型組大鼠顯著降低,其血管密度顯著降低。同時,隔藥灸組和VEGFR抑制劑組大鼠結腸血管復雜度等級顯著降低。以上結果提示隔藥灸治療可能是通過抑制結腸炎大鼠腸道血管生成,達到降低腸道炎癥反應之目的。

此外,本研究使用三維成像追蹤結腸血管生成打破常規的二維研究血管的局限,從三維角度揭示隔藥灸治療結腸炎的新機制,為隔藥灸應用于臨床結腸炎的治療提供了更加強有力的實驗資料和科學依據。與傳統的二維組織學相比,經透明化處理的標本可以對腫瘤進行更準確、客觀的分析,因此未來可以應用組織透明化技術處理結腸炎相關性癌變動物模型的結腸組織,標記血管生成等的相關蛋白,從三維角度研究針灸對結腸炎相關性癌變血管生成等方面的作用機理,為臨床提供可視化診斷和治療依據。

[1] Liu TC, Stappenbeck TS. Genetics and Pathogenesis of Inflammatory Bowel Disease[J]., 2016, 11:127-148.

[2] Seyedian SS, Nokhostin F, Malamir MD. A review of the diagnosis, prevention, and treatment methods of inflammatory bowel disease[J]., 2019,12(2):113-122.

[3] Danese S, Sans M, de la Motte C,. Angiogenesis as a novel component of inflammatory bowel disease pathogenesis[J]., 2006,130(7):2060- 2073.

[4] 陳芳,殷玉婷,劉億,等.苦參素減輕三硝基苯磺酸誘導結腸炎大鼠的炎癥損傷及其機制[J].細胞與分子免疫學雜志,2019,35(1):1-5.

[5] Kihara N, de la Fuente SG, Fujino K,. Vanilloidreceptor-1 containing primary sensory neurones mediate dextran sulphate sodium induced colitis in rats[J]., 2003,52(5):713-719.

[6] Yousefi-Ahmadipour A, Ebrahimi-Barough S, Niknia S,. Therapeutic effects of combination of platelet lysate and sulfasalazine administration in TNBS-induced colitis in rat[J]., 2020,125:109949.

[7] Ohayon D, De Chiara A, Dang PM,. Cytosolic PCNA interacts with p47phox and controls NADPH oxidase NOX2 activation in neutrophils[J]., 2019,216(11):2669-2687.

[8] Tian Y, Xu J, Li Y,. MicroRNA-31 reduces infl- ammatory signaling and promotes regeneration in colon epithelium, and delivery of mimics in microspheres reduces colitis in mice[J]., 2019,156(8):2281-2296.

[9] Joos S, Wildau N, Kohnen R,. Acupuncture and moxibustion in the treatment of ulcerative colitis: a randomized controlled study[J]., 2006,41(9):1056-1063.

[10] 包春輝,鐘捷,劉慧榮,等.針灸對活動期克羅恩病患者負性情緒及血漿色氨酸代謝的影響[J].中國針灸,2021,41(1):17-22.

[11] 包春輝,吳璐一,吳煥淦,等.針灸治療活動期克羅恩病:隨機對照研究[J].中國針灸,2016,36(7):683-688.

[12] 鐘蕊,翁志軍,趙繼夢,等.艾灸治療潰瘍性結腸炎效應機制研究進展[J].世界中醫藥,2020,15(15): 2354-2358.

[13] Ji J, Huang Y, Wang XF,. Review of clinical studies of the treatment of ulcerative colitis using acupuncture and moxibustion[J]., 2016,2016: 9248589.

[14] Ji J, Lu Y, Liu H,. Acupuncture and moxibustion for inflammatory bowel diseases: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials[J]., 2013,2013: 158352.

[15] 趙繼夢,吳煥淦,陸嫄,等.隔藥灸對潰瘍性結腸炎大鼠結腸NF-kB和STAT3活性的免疫調節機制[J].世界科學技術-中醫藥現代化,2018,20(9):1579-1584.

[16] 顧沐恩,趙繼夢,吳煥淦,等.隔姜灸天樞穴對UC大鼠結腸組織的mi RNA表達譜的影響[J].上海針灸雜志,2020,39(6):766-774.

[17] 黃艷,竇傳字,黃任佳,等.從表觀遺傳修飾角度探討艾灸對炎癥性腸病的調控機制[J].中國組織工程研究,2015,19(2):294-299.

[18] 李瑛澤,邵志華,李思光.組織器官透明化技術在三維成像研究中的應用[J].解剖學報,2018,49(3): 400-405.

[19] Zhao C, Bao CH, Li J,. Moxibustion and acupunc- ture ameliorate Crohn’s Disease by regulating the balance between Th17 and Treg cells in the intestinal mucosa[J]., 2015,2015:938054.

[20] Bao CH, Zhao JM, Liu HR,. Randomized controlled trial: moxibustion and acupuncture for the treatment of Crohn’s disease[J]., 2014,20(31): 11000-11011.

[21] Feng Y, Cui P, Lu X,. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions[J]., 2017,7:44810.

[22] Ma T, Cui P, Tong X,. Endogenous ovarian angi- ogenesis in polycystic ovary syndrome-like rats induced by low-frequency electro-acupuncture: The CLARITY three-dimensional approach[J]., 2018, 19(11):3500.

[23] Tong X, Liu Y, Xu X,. Ovarian innervation coupling with vascularity: the role of electro-acupuncture in follicular maturation in a rat model of polycystic ovary syndrome[J]., 2020,11:474.

[24] Szewczyk G, Maciejewski TM, Szukiewicz D. Current progress in the inflammatory background of angiogenesis in gynecological cancers[J]., 2019,68(4): 247-260.

[25] Aguilar-Cazares D, Chavez-Dominguez R, Carlos-Reyes A,. Contribution of angiogenesis to inflammation and cancer[J]., 2019,9:1399.

[26] Rutella S, Fiorino G, Vetrano S,. Infliximab therapy inhibits inflammation-induced angiogenesis in the mu- cosa of patients with Crohn’s disease[J]., 2011,106(4):762-770.

[27] Alkim C, Alkim H, Koksal AR,. Angiogenesis in inflammatory bowel disease[J]., 2015,2015: 970890.

[28] Wang L, Wang S, Xue A,. Thalidomide inhibits angiogenesis via down regulation of VEGF and angiopoietin-2 in Crohn’s disease[J]., 2020.doi:10.1007/s10753-020-01378-8.

Study of the Effect of Moxibustion on Intestinal Angiogenesis in Colitis Rats Using Three-dimensional Imaging

1,-2,-1,-3,-3,1,-3,-3,-1,2,-3.

1.,,200030,; 2.,,,200032,; 3.,200030,

To observe the effect of herb-partitioned moxibustion on intestinal angiogenesis in rats with experimental colitis induced by TNBS using tissue clearing technology, and to explore the potential mechanism of herb-partitioned moxibustion treatment of colitis at the three dimensional level.The colitis rat model was established by TNBS via enema, and the rats were randomly divided into a normal group, a model group, a herb-partitioned moxibustion group and an inhibitor group, with 8 rats in each group. The herb-partitioned moxibustion group was treated with herb-partitioned moxibustion at Tianshu (ST25) and Qihai (CV6); the inhibitor group received intraperitoneal injection of 10 mg/mL vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR) inhibitor at 1 mL/kg. HE staining was used to observe the histopathological changes of colon tissues in each group; the CUBIC tissue clearing technique was used to clear rat colon tissues, the platelet endothelial cells were stained and labeled with PECAM-1/CD31, and Imaris three-dimensional image processing software was used to perform three-dimensional measurement and analysis of the colonic vascular network.HE staining result showed that the morphological structure of colon in the model group was disordered, the lamina propria of mucosa presented with obvious slit-like ulcers, and a large number of inflammatory cell infiltration; the above-mentioned pathological changes were alleviated in the herb-partitioned moxibustion group and the inhibitor group, along with mucosal epithelial repair. The three-dimensional measurement and analysis of colonic vascular network demonstrated that compared with the normal group, the colonic histopathology score increased significantly in the model group, the average colonic blood vessel density increased, the blood vessel branch grade increased, and the blood vessel diameter decreased; compared with the model group, the colonic histopathological score dropped significantly in the herb- partitioned moxibustion group and the inhibitor group, the average colonic blood vessel density decreased, the blood vessel branch grade decreased, and the blood vessel diameter increased; there were no significant differences between the herb-partitioned moxibustion group and the inhibitor group.Herb-partitioned moxibustion can effectively reduce intestinal inflammation and tissue damage, and inhibit colonic angiogenesis in colitis rats, thus achieving therapeutic effect for colitis.

Acupuncture-moxibustion; Colitis; Herbal cake moxibustion therapy; Tissue Transparency; Angiogenesis; Three-dimensional imaging; TNBS

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2021.13.0018

1005-0957(2021)10-1267-08

國家自然科學基金項目(81973953,81973955,81674074);上海市衛生計生委優秀人才培養計劃項目(2018YQ11)

祁琴(1992—),女,2018級博士生,Email:qqqiqin2478@126.com

吳煥淦(1956—),男,教授,博士生導師,Email:wuhuangan@126.com

馮異(1976—),女,教授,博士生導師,Email:fengyi17@fudan.edu.cn

2021-01-31