尿路感染B群鏈球菌的耐藥特征與CAMP試驗敏感性分析

時翠銷，王 剛，李亞娟，黃 穎，徐元宏

B群鏈球菌(group B

Streptococcus

，GBS)又名無乳鏈球菌，常寄居于呼吸道、泌尿生殖道、胃腸道，是一種重要的人類機會致病菌，引起多種侵襲性疾病。 雖然醫院感染最常見的致病菌為革蘭陰性桿菌，但是GBS在20世紀90年代已成為成人急性泌尿系統感染的重要原因，關于尿路感染的GBS耐藥特征及耐藥基因研究較少。CAMP反應基于

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基因編碼的CAMP因子的促溶血活性，CAMP因子在金黃色葡萄球菌分泌的鞘磷脂酶的作用下引起紅細胞膜裂解，產生的溶血反應臨床上常用于鑒定GBS。最近，也有研究用PCR檢測

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基因來鑒定GBS。自21世紀初以來，已有在針對牛乳腺炎的研究中分離出CAMP陰性的GBS。該研究對尿液標本中分離的51株GBS進行藥物敏感性試驗及耐藥基因檢測，以了解尿路感染GBS的耐藥特征，為臨床合理使用抗生素提供參考；探究CAMP試驗和

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基因作為臨床鑒定GBS指標的敏感性。

1 材料與方法

1.1 菌株來源與鑒定

收集安徽醫科大學第一附屬醫院2019年6月—2020年9月保存的來自尿液標本的GBS共51株，已去除相同患者及因凍存不當死亡的菌株。菌種接種于羊血平板，長出菌落后，進行觸酶試驗，經基質輔助激光解吸電離飛行質譜 (MALDI-TOF MS，法國生物梅里埃公司) 重新鑒定，質譜鑒定實驗質控菌株為大腸埃希菌ATCC 8739 。

1.2 CAMP試驗

研究使用2個批次哥倫比亞羊血平板(合肥天達診斷試劑有限公司)，無乳鏈球菌ATCC 13813和化膿鏈球菌ATCC 19615分別為陽性質控和陰性質控菌株。將產溶血素的金黃色葡萄球菌ATCC 25923在血瓊脂平板上劃一橫線，再取收集的GBS與前一劃線作垂直接種，兩者相距0.5～1 cm, 接種后，將羊血平板在35～37 ℃需氧培養18～24 h。采用2個批次的血平板做重復實驗，垂直線交界處的β-溶血的箭頭形區域為陽性CAMP反應，彩虹樣細溶血區域為弱陽性CAMP反應，無溶血區域為陰性CAMP反應。

1.3 細菌藥物敏感性試驗

采用紙片擴散法(英國Oxoid公司)和Vitek 2 Compact 自動化微量肉湯稀釋法(法國梅里埃生物公司)進行藥物敏感性試驗，結果判讀及解釋參照CLSI和EUCAST文件進行。

1.4 紅霉素誘導的克林霉素耐藥檢測

紅霉素耐藥、克林霉素敏感或中介的GBS, 紅霉素(15 μg/片)和克林霉素(2 μg/片)藥敏紙片邊緣相隔12 mm放置。35 ℃培養18～24 h，靠近紅霉素藥敏紙片一側的克林霉素抑菌圈出現“截平”現象，即誘導克林霉素耐藥試驗陽性，為誘導表型(iMLSB)。

1.5 耐藥基因、16S rRNA及

基因檢測

參照文獻設計紅霉素、克林霉素、四環素、喹諾酮類等抗生素耐藥基因引物，以及16S rRNA、

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基因引物，引物均由上海生工生物公司合成，引物序列見表1。煮沸法提取細菌總DNA：將菌種接種于哥倫比亞血瓊脂平板上，35 ℃培養18～24 h，挑取新鮮的單克隆菌落于500 μl TE緩沖液中，振蕩器上渦旋混勻后于水浴鍋中煮15 min，冰上放置5 min后，12 000 r/min離心10 min，離心后取300 μl上清液為DNA模板。PCR擴增耐藥基因條件如下：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，42～55 ℃退火60 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸5 min。通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離(1.2%，110 V，40 min)，并由上海生工進行測序，測序結果與GenBank上的核苷酸庫進行BLAST比對。

表1 16S rRNA、cfb及耐藥基因引物序列

1.6 統計學處理

采用WHONET 5.6軟件對細菌藥物敏感性結果進行統計分析，計算PCR法檢測耐藥基因、16S rRNA 和

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基因的檢出率。

2 結果

2.1 感染GBS患者的一般臨床資料及科室分布

51例感染GBS的患者中，男性23例，女性28例，男女比例為1 ∶1.2。易感人群為中老年群體，年齡≥45歲的有41例(80.4%)，<45歲的僅有10例(19.6%)。患者主要分布在泌尿外科和內分泌科，分別為24例(47.1%)、16例(31.4%)，風濕免疫科、血液內科、皮膚性病科、國際醫療全科醫學科各1例(2%)，腎臟內科5例(9.8%)，消化內科2例(3.9%)。

2.2 CAMP試驗結果

51株GBS中，CAMP陰性3株，弱陽性9株，陽性39株。見圖1。

圖1 CAMP試驗結果A：1、2、3為CAMP試驗陰性；B：4、5、6為CAMP試驗弱陽性；C：7、8、9為CAMP試驗陽性；P：陽性對照；N：陰性對照

2.3 細菌藥物敏感性分析

藥物敏感性結果顯示，51株GBS對氨芐西林、達托霉素、利奈唑胺、呋喃妥因、青霉素、奎奴普丁/達福普汀、替加環素、萬古霉素均敏感，對喹諾酮類抗生素左氧氟沙星、環丙沙星、莫西沙星及克林霉素比較敏感，耐藥率分別為47.1%、49.0%、47.1%、49.0%，對四環素、紅霉素耐藥性高，耐藥率均為66.7%。紅霉素、克林霉素均敏感型10株，紅霉素耐藥的34株GBS中，有22 株 (64.7%)為固有表型(cMLSB)，5株 (14.7%) 為iMLSB型，M型有7株 (20.6%)，克林霉素耐藥的25株GBS中L型有3株 (12%)。見表2。

表2 尿液中51株GBS藥敏結果[n(%)]

2.4 耐藥基因檢測結果

通過對尿液中51株GBS的紅霉素耐藥基因ermA、ermB、mefA/E，克林霉素耐藥基因linB，四環素耐藥基因tetM、tetO, 喹諾酮耐藥基因gyrA、parC進行PCR擴增及測序顯示，所有耐藥基因均有檢出，ermA、ermB、mefA/E檢出率分別為43.1%、51.0%、33.3%，linB檢出率為11.8%，tetM、tetO檢出率分別為43.1%、23.5%，40株GBS同時檢出gyrA、parC，檢出率為78.4%，無單獨檢出gyrA或parC的GBS。GBS耐藥菌株與其攜帶相關耐藥基因具有一定相關性，34株紅霉素耐藥的GBS都至少含有一種紅霉素耐藥基因，34株四環素耐藥菌株32株(94.1%)含有四環素耐藥基因，喹諾酮耐藥的菌株均含gyrA、parC耐藥基因，14株喹諾酮抗生素敏感的GBS也含有gyrA、parC耐藥基因，25株克林霉素耐藥的GBS僅有6株含有linB耐藥基因。見表3。

表3 51株GBS耐藥基因分布情況

2.5 16S rRNA和

基因檢測結果

經PCR檢測顯示，51株GBS 16S rRNA檢出率為100%，

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基因檢出47株，檢出率92.2% (47/51)，其中CAMP試驗陰性株有1株

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基因陽性(1/3)，弱陽性株7株陽性(7/9)，CAMP試驗陽性株

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基因全部陽性(39/39)。PCR檢測結果見圖2、3和表4。

表4 51株GBS基因分布情況[n(%)]

圖2 16S rRNA基因片段的PCR擴增M1：marker 2000；1～3：CAMP試驗陰性株；4～6：CAMP試驗弱陽性株；7～9：CAMP試驗陽性株

圖3 cfb基因的PCR擴增M2：marker 2000；1～3: CAMP試驗陰性株；4～6：CAMP試驗弱陽性株；7～9：CAMP試驗陽性株

2.6 菌株鑒定結果

經生化試驗、16S rRNA、

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基因、MALDI-TOF MS鑒定，

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、16S rRNA測序結果BLAST比對，與GBS (登錄號：CP008813.1)同源性約為99%。觸酶試驗陰性，16S rRNA、MALDI-TOF MS 鑒定結果均為GBS。CAMP試驗分別為陰性、弱陽性、陽性的三株菌株鑒定結果見表5。

表5 菌株鑒定結果

3 討論

GBS可引起嚴重感染，特別是新生兒和產婦多見，如新生兒敗血癥、產后敗血癥、心內膜炎和細菌性關節炎。近年來，GBS成為成人尿路感染的重要病原體。GBS分離株的藥物敏感性試驗對于合理選擇抗生素至關重要，本研究中51株GBS均分離自尿液標本，對氨芐西林、達托霉素、利奈唑胺、呋喃妥因、青霉素、奎奴普丁/達福普汀、替加環素、萬古霉素敏感性都為100%，對四環素、紅霉素、克林霉素、喹諾酮類抗生素耐藥率高。藥敏結果表明，尿路感染的GBS與其他路徑感染的GBS耐藥特征總體相仿，但對紅霉素及四環素耐藥率高(66.7%)，iMLSB型有5株，臨床上應報告分離株克林霉素耐藥。

青霉素是成人侵襲性GBS疾病的一線治療藥物，目前普遍認為GBS在體外對青霉素敏感，在來自日本的分離株中檢測到青霉素敏感性降低，被認為是青霉素結合蛋白(PBP)2X表達降低所致。本研究中，尿路感染的GBS菌株對青霉素敏感性為100%，表明青霉素仍是治療GBS感染的較佳選擇，而對青霉素過敏的患者,可用紅霉素和克林霉素替代。研究中觀察到54.9%的分離株多重耐藥，以紅霉素、克林霉素和四環素共耐藥(27.5%)為主。

紅霉素和四環素的耐藥率 (66.7%) 較高，主要耐藥基因為ermB和tetM，廣東地區紅霉素耐藥也是主要由ermB介導，25株克林霉素耐藥的GBS僅檢出6株介導克林霉素耐藥的linB基因，這與中國南方地區(24.6%)的檢出率一致，低于南非的研究結果，而在韓國的一些調查中沒有檢測到linB基因，5株含有linB基因的GBS為紅霉素和克林霉素同時耐藥的cMLSB型，表明linB基因也可能與紅霉素耐藥有關。有研究指出parC第79位密碼子和第83位密碼子突變是高水平喹諾酮類耐藥的主要決定因素。本研究中，喹諾酮類抗生素耐藥的GBS gyrA和parC均有檢出，但是也有檢出14株喹諾酮敏感的GBS，這可能與gyrA和parC不表達有關，或者存在其他調節喹諾酮抗生素耐藥的基因或途徑。

GBS表達的CAMP因子是一種成孔蛋白毒素，其在分子水平上的協同溶血作用機制目前尚不清楚。本研究中分離出3株CAMP陰性的GBS, Hassan et al研究認為CAMP陰性株均含有

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基因，與之相反，Abdulmawjood et al分離的4株表型CAMP陰性的GBS,

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基因均為陰性，本研究3株表型CAMP陰性株僅1株

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基因陽性，2株陰性。這表明CAMP因子的表達減少或表達途徑上其他地方的基因缺陷及

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基因缺失均可能導致CAMP試驗陰性，已有研究指出影響

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基因的染色體缺失會導致CAMP試驗陰性。本研究中，CAMP試驗弱陽性的菌株中也存在2株

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基因缺失，可能還存在類似于CAMP促溶血活性的其他蛋白調節通路，有待進一步研究。有研究建立了一種新的針對

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基因片段的核酸擴增方法，敏感性為95.5%,與本研究92.2%的檢出率較為一致，這與傳統認為GBS均含有

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基因的觀點不同。因此，對于GBS的檢測CAMP試驗與

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基因檢測均缺乏一定的敏感性，應與細菌培養聯合檢測，但是對于基層醫院，CAMP試驗仍是一種簡便的檢測方法。該研究所收集的標本僅來自安徽的一所三甲醫院，后續宜擴大標本量進行更加深入和廣泛的研究。總之，藥敏試驗為臨床合理使用抗生素提供參考，該地區尿液中GBS紅霉素和四環素耐藥嚴重，耐藥基因以ermB和tetM為主，臨床上應加強對紅霉素介導的克林霉素耐藥的檢測，CAMP試驗及

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基因陰性值得關注，防止臨床檢測漏檢。