新型鴨坦布蘇病毒病亞單位疫苗安全性評價

王善輝

（江蘇省徐州生物工程職業技術學院動物工程學院，江蘇 徐州 221006）

鴨坦布蘇病毒病是由鴨坦布蘇病毒（Duck tem?busu virus，DTMUV）引起的鴨出血性卵巢炎［1，2］。自2010年4月在我國發生以來，迅速傳播到河北、山東、江蘇、安徽、浙江、福建等省份，給我國鴨養殖業帶來嚴重的經濟損失。臨床主要表現為雛鴨神經癥狀甚至死亡，產蛋鴨產蛋率急劇下降等，產蛋率可從90%迅速下降至10%，甚至停產［3］。發病率為60%~100%，死亡率為5%~30%［4］。剖檢可見卵巢變性、萎縮，主要病變特征是雛鴨肝臟有白色針尖狀壞死灶等［5］。DTMUV屬于黃病毒科、黃病毒屬、恩塔亞病毒群成員，病毒基因組為長約10 990 nt的單股正鏈RNA，編碼3個結構蛋白和7個非結構蛋白［6］。其中，E蛋白具有良好的免疫原性，是鴨坦布蘇病毒的主要保護性抗原。其表面存在大量的抗原表位，可誘導機體產生中和抗體［7］。

疫苗免疫是預防該病流行、傳播的有效手段。新型鴨坦布蘇亞單位疫苗研制項目組前期預測并合成DTMUV的E基因的融合表位蛋白（TBE），采用桿狀病毒表達系統表達了該融合表位蛋白，研制出一種新型鴨坦布蘇病毒病重組亞單位疫苗［8］。為探明該重組亞單位疫苗的安全性和保護性，本試驗將3批次實驗室疫苗制品分別以高、中、低劑量組免疫7日齡雛鴨；并以高劑量免疫200日齡產蛋鴨。通過對免疫鴨食欲、精神狀態、注射部位觀察及體重增加情況的監測及對產蛋鴨的產蛋量與孵化率進行統計以評價疫苗的安全性，攻毒保護試驗評價疫苗的保護性，旨在為疫苗進一步擴大臨床試驗打下基礎。

1 材料與方法

1.1 疫苗、毒株及動物

按照王善輝等［9］提供的方法在實驗室制備3批次的DTMUV病重組亞單位疫苗，批號分別為20201020、20201110、20201120。DTMUV病商品活疫苗（WF100株）購自齊魯動物保健品有限公司；DTMUV JSXZ株由徐州生物工程職業技術學院動物工程學院微生物學實驗室分離保存；SPF雞胚購自濟南賽斯家禽科技有限公司；櫻桃谷雛鴨、產蛋鴨購自徐州市睢寧縣某養鴨場，經檢測不含抗DTMUV的母源抗體。

1.2 分組及免疫

1.2.1 雛鴨免疫將550只7日齡櫻桃谷雛鴨隨機分成11組，50只/組，其中1~9組分別為高、中、低劑量的重組亞單位疫苗免疫組，第10組為商品活疫苗（WF100株）免疫組，第11組為非免疫對照組，注射磷酸鹽緩沖液1.5 mL/只。重組亞單位疫苗免疫組經頸部肌肉注射疫苗，1、4、7組免疫0.5 mL/只，2、5、8組免疫1.0 mL/只，3、6、9組免疫1.5 mL/只。商品疫苗組肌肉注射（0.5 mL/只）。首免2周后加強免疫。相同條件下，將各組鴨分開隔離飼養。

表1 分組及免疫劑量

1.2.2 產蛋鴨免疫200日齡櫻桃谷產蛋鴨250只，隨機均分成5組，50只/組，其中1~3組為重組亞單位疫苗免疫組，分別注射3批疫苗，1.5 mL/只；第4組為商品活疫苗免疫組，第5組為非免疫對照組，各組鴨分開隔離飼養。

1.3 安全性檢測

1.3.1 雛鴨全身及注射部位反應免疫后觀察1~3周雛鴨的精神狀態與采食情況。各免疫組及對照組隨機取5只免疫鴨，剖檢觀察疫苗吸收情況，即疫苗注射部位是否有疫苗顆粒，是否出現紅腫、出血及炎性滲出等病變。免疫后28 d每組分別隨機抽取20只免疫鴨及非免鴨稱重，比較其對增重的影響。

1.3.2 產蛋鴨產蛋量與孵化率記錄產蛋鴨免疫后30 d內的產蛋數量，并進行標記。比較免疫鴨與非免疫種鴨同期產蛋數。從產蛋鴨免疫后4~6 d內每組隨機抽取80枚入孵蛋，統計孵化率。

1.4 雛鴨免疫攻毒保護試驗

首免后28 d，于免疫組隨機抽取10只鴨，肌肉注射200 U/只（1ELD50病毒量為1 U）的DTMUV JSXZ株。分離血清用于病毒分離。經卵黃囊途徑接種6日齡SPF雞胚，每胚0.1 mL。24~72 h死亡的雞胚按照王永娟等［10］建立的方法，通過RT-PCR法檢測E基因，陽性胚判為DTMUV感染死亡雞胚。只要有1枚雞胚感染，即判定這只鴨病毒分離陽性，為發病鴨。記錄發病鴨數量，并計算各組疫苗的保護率。

2 結果與分析

2.1 雛鴨食欲、精神狀況及注射部位觀察

首次免疫后連續觀察21 d，免疫雛鴨與非免疫鴨采食、精神狀況均正常，未見任何全身不良反應。檢查免疫鴨注射部位（每組隨機取出5只鴨），所有免疫鴨均未見局部出血、滲出、水腫及肉芽腫塊或腫脹等病變。剖檢可見高劑量組個別免疫鴨在注射部位有少量微小疫苗顆粒存在，其余鴨對疫苗全部吸收良好。

2.2 雛鴨體重增長情況

由表2可見，首免后28 d時，3批次疫苗的高、中、低劑量組免疫鴨和非免疫鴨的體重無明顯差異，重組亞單位疫苗免疫沒有影響雛鴨體重。

表2 首免后28 d各組鴨平均體重

2.3 產蛋鴨的產蛋量與孵化率

產蛋鴨免疫后，每天統計各組鴨產蛋數量，連續統計30 d。結果（表3）顯示，產蛋量在免疫后第4天開始下降，下降2~3個百分點，然后逐漸恢復，到第10天已經基本恢復到同組鴨免疫前的產蛋率。且在種鴨免疫后4~6 d內每組隨機抽取80枚入孵蛋，統計孵化率，經比較免疫組與對照組無明顯差異。說明疫苗對免疫后30 d內產蛋鴨的產蛋率和免疫后4~6 d入孵蛋的孵化率無明顯影響。

表3 免疫種鴨的產蛋及孵化情況

2.4 攻毒保護試驗

雛鴨在首免后28 d攻毒，觀察15 d。非免疫組10只鴨均出現明顯的食欲不振、排綠色糞便、后期則出現癱瘓等癥狀，其中4只死亡。剖檢顯示病鴨肝臟、脾臟、腺胃、腦膜有出血、壞死等病變；商品活疫苗免疫組10只鴨未出現臨床癥狀，保護率為100%。1、4、7組分別有3只鴨出現食欲不振、排綠色糞便等輕微癥狀，15 d后癥狀基本消失，其保護率均為70%；低劑量免疫組和非免疫組所有發病鴨體內都分離到DTMUV。中、高劑量重組疫苗免疫組鴨未出現臨床癥狀，剖檢未見異常，均未分離到DTMUV，保護率均為100%。結果表明，3個批次的重組亞單位疫苗都能夠很好地保護免疫雛鴨免受DTMUV的攻擊，達到與商品活疫苗相同的保護效果（表4）。

表4 雛鴨免疫后DTMUV攻毒試驗結果

3 小結與討論

為檢測新型鴨坦布蘇亞單位疫苗研制項目組前期研制的鴨坦布蘇病毒病重組亞單位疫苗的安全性，試驗將3個批次的實驗室疫苗制品按高、中、低3個劑量組分別免疫9組7日齡雛鴨，設商品活疫苗對照組及非免疫對照組。通過觀察免疫鴨食欲、精神狀態、注射部位病變及體重增加情況來評價疫苗的安全性。

安全性試驗結果顯示，免疫鴨食欲、精神狀態均正常，注射部位未見明顯病變，體重增長情況與非免疫組鴨一致。產蛋鴨免疫后，每天統計各組鴨產蛋數量，連續統計30 d，結果顯示，產蛋量在免疫后第4天開始下降，下降2~3個百分點，然后逐漸恢復，到第10天已經基本恢復到同組鴨免疫前的產蛋率。在種鴨免疫后4~6 d內每組隨機抽取80枚入孵蛋，統計孵化率，結果發現免疫組與對照組無明顯差異，說明疫苗對免疫后30 d內產蛋鴨的產蛋率和免疫后4~6 d入孵蛋的孵化率無明顯影響。

攻毒保護試驗結果顯示，低劑量組保護率為70%，中、高劑量組與商品活疫苗組的保護率均為100%，非免疫對照組雛鴨均表現為典型的DTMUV感染癥狀，其中4只死亡。說明重組亞單位疫苗能夠很好地保護免疫鴨免受DTMUV的攻擊，達到與商品活疫苗相同的保護效果。以上結果表明，該重組亞單位疫苗具有良好安全性及保護性。本研究為該疫苗的進一步擴大臨床試驗及推廣應用打下了一定的基礎。