高效液相色譜-質(zhì)譜法檢測水產(chǎn)品中硝基呋喃 及其代謝物的研究

劉 薇，尚 勇

（南昌市檢驗(yàn)檢測中心農(nóng)產(chǎn)品檢測分中心，江西南昌 330009）

自從1944年M.C.Dodd和W.B.Stillman發(fā)現(xiàn)5-硝基呋喃衍生物有抑菌作用后[1]，大量的硝基呋喃類藥物被合成并廣泛運(yùn)用于醫(yī)學(xué)和畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域。因?yàn)槠鋬r(jià)格低且效果好，曾在水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛用于預(yù)防和治療由革蘭氏細(xì)菌引起的水產(chǎn)動(dòng)物胃腸道疾病[2]。但研究表明，硝基呋喃類藥物具有嚴(yán)重的致癌、致畸胎等毒副作用[3]。我國農(nóng)業(yè)部于2002年12月24日發(fā)布的第235號(hào)公告及2005年10月28日發(fā)布的第560號(hào)公告中，硝基呋喃類藥物被列為飼養(yǎng)過程中的禁用藥物，在動(dòng)物性食品中不得檢出[4]。目前，全球大多數(shù)國家已將其列為禁用藥物，水產(chǎn)品中硝基呋喃類藥物的檢測方法也很多，但因液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法能夠充分發(fā)揮超高效液相色譜的高分離度、高速以及串聯(lián)質(zhì)譜的高特異性和高靈敏度的作用，在水產(chǎn)品檢測硝基呋喃時(shí)尤為常用[5]。本試驗(yàn)采用內(nèi)標(biāo)法定量，回收率較高且結(jié)果穩(wěn)定，適用于實(shí)驗(yàn)室批量處理水產(chǎn)品硝基呋喃類代謝物的檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

三重四級(jí)桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀API 4000+（AB SCIEX 公司）；超高效液相色譜儀LC-30A（日本島津公司）；pH計(jì)（美國奧豪斯上海公司）；空氣搖床（上海喆圖科學(xué)儀器）；電子天平（上海舜宇科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 材料與試劑

AHD標(biāo)準(zhǔn)品（德國WITEGA實(shí)驗(yàn)室，100 μg/mL）；SEM標(biāo)準(zhǔn)品（德國WITEGA實(shí)驗(yàn)室，100 μg/mL）；AOZ標(biāo)準(zhǔn)品（德國WITEGA實(shí)驗(yàn)室，100 μg/mL）；AMOZ標(biāo)準(zhǔn)品（德國WITEGA實(shí)驗(yàn)室，100 μg/mL）；AHD-13C3標(biāo)準(zhǔn)品（曼哈格，99.5%）；SCA-HCl-13C，15N2標(biāo)準(zhǔn)品（曼哈格，98.7%）；AOZ-D4標(biāo)準(zhǔn)品（曼哈格，98.7%）；AMOZ-D5標(biāo)準(zhǔn)品（曼哈格，99.5%）；二硝基苯甲醛（東京化成工業(yè)株式會(huì)社）；二甲亞砜（東京化成工業(yè)株式會(huì)社）；乙酸乙酯（霍尼韋爾）；正己烷（霍尼韋爾）；磷酸氫二鉀（分析純）；鹽酸（分析純）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

準(zhǔn)確稱取4種硝基呋喃代謝物標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配置成 1 mg/mL的AMOZ、AOZ、SEM、AHD標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。使用前準(zhǔn)確吸取4種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用水逐級(jí)稀釋成100 ng/mL和10 ng/mL的混合溶液，4 ℃冷藏保存。

1.3.2 樣品的處理

稱取2.0 g陰性草魚肉樣品置于50 mL離心管中，再加入50 μL混合內(nèi)標(biāo)溶液（100 ng/mL）、10 mL鹽酸 （0.2 mol/L）、300 μL的2-硝基苯甲醛溶液（0.05 mol/L），渦旋混勻1 min，置于避光、37 ℃空氣搖床中衍生16 h。取出樣品，加入約5 mL磷酸氫二鉀，調(diào)節(jié)pH值7.0～7.5，加入10 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩提取5 min，9 000 r/min離心5 min，提取全部上清液置于無刻度試管中，再加入10 mL 乙酸乙酯重復(fù)一遍，合并上清液于40 ℃下氮?dú)獯蹈伞Ｍ蹈傻脑嚬苤屑尤?.0 mL的0.1%甲酸水溶液+乙腈（9∶1），渦旋溶解，加入3 mL乙腈飽和的正己烷兩次液液分配，去除脂肪，下層水相過0.22 μm濾膜后裝瓶。另取陰性草魚肉樣，分別加入硝基呋喃類標(biāo)準(zhǔn)品，使添加濃度分別為 0.5 μg/L、1.0 μg/L、2.0 μg/L、4.0 μg/L、8.0 μg/L和12.0 μg/L，每個(gè)濃度做6個(gè)平行，進(jìn)行回收率試驗(yàn)。

1.3.3 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

島津C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，3 μm），柱溫40 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流速0.2 mL/min。流動(dòng)相梯度洗脫條件見表1。質(zhì)譜條件為電噴霧離子源（ESI），采用正離子掃描，檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測，相關(guān)參數(shù)見表2。

表1 液相色譜洗脫條件

表2 硝基呋喃類代謝物及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 硝基呋喃代謝物的標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測方法的靈敏度

按上述條件測定系列質(zhì)量濃度的4種硝基呋喃代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，硝基呋喃代謝物的線性方程和相關(guān)系數(shù)見表3。結(jié)果表明，4種硝基呋喃代謝物在0.5～12 ng/mL呈線性關(guān)系。

表3 4種硝基呋喃代謝物的回歸方程和相關(guān)系數(shù)

2.2 回收率和精密度試驗(yàn)

AMOZ、SEM、AHD及AOZ代謝物的回收率分別為84.4%～106.1%、92.5%～102.7%、93.9%～109.5%及93.1%～103.7%。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在0.4%～7.3%。方法的回收率與精密度完全可以滿足批量檢測出具報(bào)告的要求，試驗(yàn)結(jié)果見表4.

表4 不同濃度水平下硝基呋喃代謝物的加標(biāo)回收率及 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 .結(jié)論

研究建立了測定水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，相對(duì)回收率為97.8%～99.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%～7.3%，檢出限為0.25 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg。運(yùn)用經(jīng)過優(yōu)化后的方法得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定、可靠，不僅能夠提高樣品處理效率，而且能夠較好地解決陽性樣品檢測值偏低的問題。實(shí)驗(yàn)表明，本方法定量分析準(zhǔn)確，精密度好，應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測取得了滿意結(jié)果，適合于快速檢測水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物。