GC-MS檢測白酒中氨基甲酸乙酯方法的優(yōu)化

劉 艷，周 玉，劉 莎，唐艷榮，陸 瑤，孫 莉

（1湖北信嘉檢測科技有限公司，湖北咸寧 437100；2.黃鶴樓酒業(yè)有限公司，湖北武漢 430050）

氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，簡稱EC，分子式為H2NCOOC2H5），又稱尿烷，是食物在發(fā)酵或者存儲過程中天然產(chǎn)生的物質(zhì)。氨基甲酸乙酯是一種可以引起肺腫瘤、淋巴癌、肝癌、皮膚癌等疾病的可致癌物質(zhì)。發(fā)酵食品中含有氨基甲酸乙酯是食品安全的潛在危害[1]，因此，對食品中氨基甲酸乙酯含量的檢測是對消費(fèi)者健康安全的保障。氨基甲酸乙酯是一種具有潛在致癌作用的化合物，存在于傳統(tǒng)的發(fā)酵食品中；乙醇對氨基甲酸乙酯的致癌性有促進(jìn)作用[2]，國際癌癥研究署在1987年將其歸為2B類致癌物質(zhì)，在2007年對其進(jìn)行再次評估后改為2A類致癌物。加拿大衛(wèi)生與防疫部門規(guī)定蒸餾酒中氨基甲酸乙酯的限量為150 μg/L，我國目前未對氨基甲酸乙酯出臺相關(guān)的限量標(biāo)準(zhǔn)。目前，酒中的氨基甲酸乙酯的檢測方法有高效液相色譜法、氣相色譜法。其中液相色譜法前處理操作復(fù)雜且效率不高；而氣相色譜-質(zhì)譜法有著對樣品的前處理損耗低、靈敏度高、分析效率高等特點(diǎn)，在對氨基甲酸乙酯檢測的應(yīng)用中最為廣泛。本文對《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基甲酸乙酯的測定》 （GB 5009.223—2014）的方法進(jìn)行了一定的改進(jìn)，更換了GC-MS的色譜柱[3]，以及洗脫液[4-5]，選擇了穩(wěn)定的萃取方法[6]，能夠安全有效地對白酒中的氨基甲酸乙酯進(jìn)行檢測。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

試劑：氯化鈉（NaCl）；正己烷（C6H14）色譜純；甲醇 （CH40）色譜純；二氯甲烷（CH2Cl2）色譜純；氨基甲酸乙酯專用萃取柱（CLEANERT）。

標(biāo)準(zhǔn)品：氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品（C3H7O2N；CAS：51-79-6）純度＞99.0%；D5-氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品（C3H2D5NO2；CAS：73962-07-9）純度＞99%。

樣品：市售白酒、自釀原酒。

儀器：氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（安捷倫8860-5977B）；全自動固相萃取儀（睿科FS360）；氮吹儀；電子天平；漩渦振蕩混合器；超聲波清洗機(jī)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

（1）D5-氨基甲酸乙酯儲備液（1.00 mg/mL）。準(zhǔn)確稱取0.01 g（精確到0.000 1 g）D5-氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，定容到10 mL，備用。

（2）D5-氨基甲酸乙酯使用液（2.00 μg/mL）。取D5-氨基甲酸乙酯儲備液（1.00 mg/mL）0.10 mL，用甲醇定容至50 mL，備用。

（3）標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1.00 mg/mL）。稱取0.05 g（精確到 0.000 1 g）氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至50 mL。

（4）標(biāo)準(zhǔn)中間液①（10.0 μg/mL）。取氨基甲酸乙酯儲備液（1.00 mg/mL）1.00 mL，用甲醇定容至100 mL，備用。

（5）標(biāo)準(zhǔn)中間液②（0.50 μg/mL）。取氨基甲酸乙酯中間液①（10.0 μg/mL）5.00 mL，用甲醇定容至100 mL,備用。

（6）標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)中間液②（0.50 μg/mL）20.0 μL、50.0 μL、100.0 μL、200.0 μL、400.0 μL和標(biāo)準(zhǔn)中間液①（10.0μg/mL）40.0 μL、100.0 μL于7個1 mL容量瓶中；各加入D5-氨基甲酸乙酯使用液（2.00 μg/mL）100 μL，甲醇定容。使D5-氨基甲酸乙酯濃度為200 ng/mL,標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度分別為10.0 ng/mL、25.0 ng/mL、50.0 ng/mL、100.0 ng/mL、200.0 ng/mL、400.0 ng/mL和1 000.0 ng/mL。

1.2.2 樣品前處理

準(zhǔn)確量取2.00 mL酒樣于10 mL玻璃試管中，稱重并記錄酒樣的質(zhì)量m（精確到0.001 g）；加入100.0 μLD5-氨基甲酸乙酯使用液（2.00 μg/mL），再加入0.3 g氯化鈉（經(jīng)過640 ℃烘2 h），超聲溶解，再轉(zhuǎn)移到萃取柱中。固相萃取儀設(shè)置的樣品制備流程見表1將洗脫液在室溫下用氮?dú)饩従彺抵良s0.5 mL，用甲醇定容到1.00 mL，此為待測液，供GC-MS檢測分析。

表1 固相萃取儀萃取流程表

1.2.3 儀器條件

色 譜 柱：DB-WAX UI柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度220 ℃；柱溫：初始溫度50 ℃，以15 ℃/min速率升至155 ℃，再以5 ℃/min的速率升至185 ℃后運(yùn)行：240 ℃運(yùn)行5 min。不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣體積1 μL；載氣：氮?dú)猓兌取?9.999%）；流速1 mL/min；電離模式：EI源，離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；溶劑延遲11 min。氨基甲酸乙酯選擇監(jiān)測離子（m/z）：44、62、74、89；定量離子：62；D5-氨基甲酸乙酯選擇監(jiān)測離子（m/z）：64、76；定量離子：64。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)標(biāo)物的選擇

該方法的內(nèi)標(biāo)物為D5-氨基甲酸乙酯，其是與氨基甲酸乙酯具有相同分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定同位素，且具有一致的物理化學(xué)性質(zhì)，能夠有效消除基質(zhì)效應(yīng)和前處理等因素對分析結(jié)果的影響；在色譜分析中又能與待測物進(jìn)行充分地分離；最重要的是D5-氨基甲酸乙酯是一種人工合成物質(zhì)，無法在生產(chǎn)過程中自然產(chǎn)生。這些特點(diǎn)使D5-氨基甲酸乙酯作為該檢測方法的內(nèi)標(biāo)物，大大優(yōu)于氨基甲酸丙酯。

此分析方法在預(yù)處理前加入內(nèi)標(biāo)物，當(dāng)混合溶液中的待測物和內(nèi)標(biāo)物的比值恒定時，可以消除在預(yù)處理過程中帶入的不穩(wěn)定性因素的影響。

2.2 洗脫溶液的選擇

此方法的洗脫液使用的是二氯甲烷。二氯甲烷無色透明，易揮發(fā)，具有類似醚的輕微刺激味道，且毒性小，穩(wěn)定性高，可很好地吸附固相萃取柱中的氨基甲酸乙酯；又因其易揮發(fā)，氮吹時能大大節(jié)約時間，提高效率；《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基甲酸乙酯的測定》（GB 5009.223—2014）中所使用的5%乙酸乙酯-乙醚溶液，具有強(qiáng)烈的刺激性氣味，在通風(fēng)良好的環(huán)境也會對操作者的眼睛及呼吸系統(tǒng)也會產(chǎn)生強(qiáng)烈刺激，不利于操作者的身心健康。因此，該方法選擇了二氯甲烷作為洗脫液，二氯甲烷在通風(fēng)良好的空間中氣味小，有更好的環(huán)保安全性。

2.3 色譜柱的選擇

本 試 驗(yàn) 選 擇 的 是DB-WAX UI柱（60 m×0.25 mm× 0.25 μm）。該色譜柱為超惰性色譜柱，不易與化合物產(chǎn)生吸附作用，固定相可用溶劑沖洗，并可耐受水溶液進(jìn)樣。在分析時能夠更加有效地分離氨基甲酸乙酯，提供對稱的峰形和更高的響應(yīng)。且該色譜柱可以檢測部分農(nóng)藥殘留的檢測項(xiàng)目，適用范圍廣泛，適用性強(qiáng)。氨基甲酸乙酯與其內(nèi)標(biāo)物的峰形完整且完全分開。該方法的內(nèi)標(biāo)物在12.19 min出峰，目標(biāo)物在12.27 min出峰。

2.4 工作曲線及線性

取1.2.1中所配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品，用設(shè)定好的儀器條件對其進(jìn)行檢測。以濃度（ng/mL）為X軸，響應(yīng)（峰面積）為Y軸，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=98.566X-542.66，R2=0.999 7。氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性圖見圖1。

圖1 氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性

2.5 準(zhǔn)確度和精密度

用本方法對市售白酒和自釀原酒進(jìn)行分析，根據(jù)樣品的氨基甲酸乙酯含量和曲線濃度范圍，添加了不同濃度的加標(biāo)樣進(jìn)行檢測。樣品的回收率為99.6%～103%；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.5%～4.4%。樣品回收率測定結(jié)果及精密度試驗(yàn)結(jié)果分別見表2和表3。

表2 樣品中氨基甲酸乙酯測定的加標(biāo)回收率測定結(jié)果

表3 樣品中氨基甲酸乙酯測定的重復(fù)性

3 結(jié)論

本文討論了GC-MS檢測白酒中的氨基甲酸乙酯的新方法，著重討論了樣品前處理的洗脫液，色譜柱的使用以及對內(nèi)標(biāo)物的選擇，并分析了其優(yōu)缺點(diǎn)。同時通過試驗(yàn)得出該方法檢測的回收率為95%～105%；相對偏差為0.5%～4.5%。經(jīng)過優(yōu)化后，對氨基甲酸乙酯的檢測具有良好的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度，能夠滿足白酒中氨基甲酸乙酯的測定要求。

與《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基甲酸乙酯的測定》（GB 5009.223—2014）相比較，本方法選擇了D5-氨基甲酸乙酯作為內(nèi)標(biāo)物，避免了樣品的基底效應(yīng)；更換了洗脫溶液，避免了乙酸乙酯的刺鼻氣味，使得前處理簡單高效；更換了色譜柱，提高了靈敏度的同時也提高了色譜柱的應(yīng)用的廣泛性。