GC-MS檢測白酒中氨基甲酸乙酯方法的優化

劉 艷，周 玉，劉 莎，唐艷榮，陸 瑤，孫 莉

（1湖北信嘉檢測科技有限公司，湖北咸寧 437100；2.黃鶴樓酒業有限公司，湖北武漢 430050）

氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，簡稱EC，分子式為H2NCOOC2H5），又稱尿烷，是食物在發酵或者存儲過程中天然產生的物質。氨基甲酸乙酯是一種可以引起肺腫瘤、淋巴癌、肝癌、皮膚癌等疾病的可致癌物質。發酵食品中含有氨基甲酸乙酯是食品安全的潛在危害[1]，因此，對食品中氨基甲酸乙酯含量的檢測是對消費者健康安全的保障。氨基甲酸乙酯是一種具有潛在致癌作用的化合物，存在于傳統的發酵食品中；乙醇對氨基甲酸乙酯的致癌性有促進作用[2]，國際癌癥研究署在1987年將其歸為2B類致癌物質，在2007年對其進行再次評估后改為2A類致癌物。加拿大衛生與防疫部門規定蒸餾酒中氨基甲酸乙酯的限量為150 μg/L，我國目前未對氨基甲酸乙酯出臺相關的限量標準。目前，酒中的氨基甲酸乙酯的檢測方法有高效液相色譜法、氣相色譜法。其中液相色譜法前處理操作復雜且效率不高；而氣相色譜-質譜法有著對樣品的前處理損耗低、靈敏度高、分析效率高等特點，在對氨基甲酸乙酯檢測的應用中最為廣泛。本文對《食品安全國家標準 食品中氨基甲酸乙酯的測定》 （GB 5009.223—2014）的方法進行了一定的改進，更換了GC-MS的色譜柱[3]，以及洗脫液[4-5]，選擇了穩定的萃取方法[6]，能夠安全有效地對白酒中的氨基甲酸乙酯進行檢測。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

試劑：氯化鈉（NaCl）；正己烷（C6H14）色譜純；甲醇 （CH40）色譜純；二氯甲烷（CH2Cl2）色譜純；氨基甲酸乙酯專用萃取柱（CLEANERT）。

標準品：氨基甲酸乙酯標準品（C3H7O2N；CAS：51-79-6）純度＞99.0%；D5-氨基甲酸乙酯標準品（C3H2D5NO2；CAS：73962-07-9）純度＞99%。

樣品：市售白酒、自釀原酒。

儀器：氣相色譜-質譜聯用儀（安捷倫8860-5977B）；全自動固相萃取儀（睿科FS360）；氮吹儀；電子天平；漩渦振蕩混合器；超聲波清洗機。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液配制

（1）D5-氨基甲酸乙酯儲備液（1.00 mg/mL）。準確稱取0.01 g（精確到0.000 1 g）D5-氨基甲酸乙酯標準品，用甲醇溶解，定容到10 mL，備用。

（2）D5-氨基甲酸乙酯使用液（2.00 μg/mL）。取D5-氨基甲酸乙酯儲備液（1.00 mg/mL）0.10 mL，用甲醇定容至50 mL，備用。

（3）標準儲備液（1.00 mg/mL）。稱取0.05 g（精確到 0.000 1 g）氨基甲酸乙酯標準品，用甲醇溶解并定容至50 mL。

（4）標準中間液①（10.0 μg/mL）。取氨基甲酸乙酯儲備液（1.00 mg/mL）1.00 mL，用甲醇定容至100 mL，備用。

（5）標準中間液②（0.50 μg/mL）。取氨基甲酸乙酯中間液①（10.0 μg/mL）5.00 mL，用甲醇定容至100 mL,備用。

（6）標準曲線的配制。分別吸取標準中間液②（0.50 μg/mL）20.0 μL、50.0 μL、100.0 μL、200.0 μL、400.0 μL和標準中間液①（10.0μg/mL）40.0 μL、100.0 μL于7個1 mL容量瓶中；各加入D5-氨基甲酸乙酯使用液（2.00 μg/mL）100 μL，甲醇定容。使D5-氨基甲酸乙酯濃度為200 ng/mL,標準曲線濃度分別為10.0 ng/mL、25.0 ng/mL、50.0 ng/mL、100.0 ng/mL、200.0 ng/mL、400.0 ng/mL和1 000.0 ng/mL。

1.2.2 樣品前處理

準確量取2.00 mL酒樣于10 mL玻璃試管中，稱重并記錄酒樣的質量m（精確到0.001 g）；加入100.0 μLD5-氨基甲酸乙酯使用液（2.00 μg/mL），再加入0.3 g氯化鈉（經過640 ℃烘2 h），超聲溶解，再轉移到萃取柱中。固相萃取儀設置的樣品制備流程見表1將洗脫液在室溫下用氮氣緩緩吹至約0.5 mL，用甲醇定容到1.00 mL，此為待測液，供GC-MS檢測分析。

表1 固相萃取儀萃取流程表

1.2.3 儀器條件

色 譜 柱：DB-WAX UI柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度220 ℃；柱溫：初始溫度50 ℃，以15 ℃/min速率升至155 ℃，再以5 ℃/min的速率升至185 ℃后運行：240 ℃運行5 min。不分流進樣；進樣體積1 μL；載氣：氮氣（純度≥99.999%）；流速1 mL/min；電離模式：EI源，離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；溶劑延遲11 min。氨基甲酸乙酯選擇監測離子（m/z）：44、62、74、89；定量離子：62；D5-氨基甲酸乙酯選擇監測離子（m/z）：64、76；定量離子：64。

2 結果與分析

2.1 內標物的選擇

該方法的內標物為D5-氨基甲酸乙酯，其是與氨基甲酸乙酯具有相同分子結構的穩定同位素，且具有一致的物理化學性質，能夠有效消除基質效應和前處理等因素對分析結果的影響；在色譜分析中又能與待測物進行充分地分離；最重要的是D5-氨基甲酸乙酯是一種人工合成物質，無法在生產過程中自然產生。這些特點使D5-氨基甲酸乙酯作為該檢測方法的內標物，大大優于氨基甲酸丙酯。

此分析方法在預處理前加入內標物，當混合溶液中的待測物和內標物的比值恒定時，可以消除在預處理過程中帶入的不穩定性因素的影響。

2.2 洗脫溶液的選擇

此方法的洗脫液使用的是二氯甲烷。二氯甲烷無色透明，易揮發，具有類似醚的輕微刺激味道，且毒性小，穩定性高，可很好地吸附固相萃取柱中的氨基甲酸乙酯；又因其易揮發，氮吹時能大大節約時間，提高效率；《食品安全國家標準 食品中氨基甲酸乙酯的測定》（GB 5009.223—2014）中所使用的5%乙酸乙酯-乙醚溶液，具有強烈的刺激性氣味，在通風良好的環境也會對操作者的眼睛及呼吸系統也會產生強烈刺激，不利于操作者的身心健康。因此，該方法選擇了二氯甲烷作為洗脫液，二氯甲烷在通風良好的空間中氣味小，有更好的環保安全性。

2.3 色譜柱的選擇

本 試 驗 選 擇 的 是DB-WAX UI柱（60 m×0.25 mm× 0.25 μm）。該色譜柱為超惰性色譜柱，不易與化合物產生吸附作用，固定相可用溶劑沖洗，并可耐受水溶液進樣。在分析時能夠更加有效地分離氨基甲酸乙酯，提供對稱的峰形和更高的響應。且該色譜柱可以檢測部分農藥殘留的檢測項目，適用范圍廣泛，適用性強。氨基甲酸乙酯與其內標物的峰形完整且完全分開。該方法的內標物在12.19 min出峰，目標物在12.27 min出峰。

2.4 工作曲線及線性

取1.2.1中所配制的標準曲線的樣品，用設定好的儀器條件對其進行檢測。以濃度（ng/mL）為X軸，響應（峰面積）為Y軸，繪制的標準曲線為Y=98.566X-542.66，R2=0.999 7。氨基甲酸乙酯標準曲線及線性圖見圖1。

圖1 氨基甲酸乙酯標準曲線及線性

2.5 準確度和精密度

用本方法對市售白酒和自釀原酒進行分析，根據樣品的氨基甲酸乙酯含量和曲線濃度范圍，添加了不同濃度的加標樣進行檢測。樣品的回收率為99.6%～103%；相對標準偏差為0.5%～4.4%。樣品回收率測定結果及精密度試驗結果分別見表2和表3。

表2 樣品中氨基甲酸乙酯測定的加標回收率測定結果

表3 樣品中氨基甲酸乙酯測定的重復性

3 結論

本文討論了GC-MS檢測白酒中的氨基甲酸乙酯的新方法，著重討論了樣品前處理的洗脫液，色譜柱的使用以及對內標物的選擇，并分析了其優缺點。同時通過試驗得出該方法檢測的回收率為95%～105%；相對偏差為0.5%～4.5%。經過優化后，對氨基甲酸乙酯的檢測具有良好的靈敏度、準確度和精密度，能夠滿足白酒中氨基甲酸乙酯的測定要求。

與《食品安全國家標準 食品中氨基甲酸乙酯的測定》（GB 5009.223—2014）相比較，本方法選擇了D5-氨基甲酸乙酯作為內標物，避免了樣品的基底效應；更換了洗脫溶液，避免了乙酸乙酯的刺鼻氣味，使得前處理簡單高效；更換了色譜柱，提高了靈敏度的同時也提高了色譜柱的應用的廣泛性。