食品危害物適配體截短優(yōu)化及其應(yīng)用研究進展

梁 好，徐學明

（江南大學食品學院，江蘇無錫 214000）

食源性疾病是當前食品安全面臨的重大問題，已成為全球性公共衛(wèi)生問題之一。據(jù)有關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計，全世界范圍內(nèi)每年有數(shù)十億人患有食源性疾病，其中，我國每年發(fā)生食源性疾病人數(shù)近千萬人次[1]。因此，對食品危害物進行快速、靈敏檢測，對降低食源性疾病發(fā)生率、提高國民身體健康度及維護國家社會穩(wěn)定性具有非常重要的作用。

目前，常見的食品危害物檢測方法主要有儀器分析法、免疫分析法、平板分離法等。其中，儀器分析法包括氣相色譜法、高效液相色譜法等，這類方法具有精密度高、重復性好的優(yōu)點，但所用儀器昂貴、樣品前處理復雜；免疫分析法包括酶聯(lián)免疫吸附法、熒光免疫測定法等，但由于抗體制備成本高、重復性差，現(xiàn)場檢測的運用受到限制；平板分離法主要用于致病菌的檢測，結(jié)果穩(wěn)定性較好，但檢測周期較長，一般需要3～5 d[2]。

20世紀90年代發(fā)現(xiàn)的核酸適配體分子探針給食品危害物的檢測帶來了新的機遇。核酸適配體（Aptamer）又稱“化學抗體”，是一種能折疊成特定三維結(jié)構(gòu)并特異性結(jié)合靶標分子的單鏈DNA或RNA，一般長度在20～100個堿基之間[3]。它可以通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(shù)（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX）從體外篩選獲得，目前很多致病菌、真菌毒素、重金屬離子等食品危害物的核酸適配體均已有報道。此外，目前很多體外篩選獲得的核酸適配體序列初始長度為80 bp左右[4]，隨著人們對核酸適配體研究的深入，越來越多的研究表明，對核酸適配體序列進行截短、裂分優(yōu)化后，其仍然保有原有的功能性質(zhì)，甚至識別性能更優(yōu)越[5]。與此同時，通過序列優(yōu)化還可以進一步揭示核酸適配體序列結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，有利于理解核酸適配體-靶標作用機制。因此，核酸適配體的序列優(yōu)化及作用機制等方面的研究已逐漸成為研究熱點。本文主要總結(jié)了近年來已報道的食品危害物核酸適配體的序列優(yōu)化及其應(yīng)用情況，以期為今后食品危害物核酸適配體生物傳感器的開發(fā)和應(yīng)用提供借鑒。

1 食品危害物核酸適配體序列優(yōu)化現(xiàn)狀

截至目前，已報道的食品危害物核酸適配體大約有80種，主要包括抗生素、致病菌、農(nóng)獸藥殘留、生物毒素等，其中約有23種已被報道進行序列優(yōu)化，占比28.8%，具體如表1所示。由此可見，對核酸適配體序列進行優(yōu)化正逐漸受到廣大研究人員的關(guān)注。從表1還可以看出，目前優(yōu)化效果顯著的食品危害物核酸適配體序列之一為β-羽扇豆球蛋白，優(yōu)化后其長度縮短為11 bp，為最初適配體序列長度的12%，其親和力提高了約211倍，檢測靈敏度達150 pM，相較基于抗體的ELISA技術(shù)具有明顯的提升。因此，對核酸適配體序列進行優(yōu)化不僅可以降低序列合成成本，還有利于改善其生物傳感器的性能。

表1 近年來已報道的食品危害物截短核酸適配體

2 食品危害物核酸適配體序列優(yōu)化方法

對核酸適配體序列優(yōu)化的目的主要包括兩個方面：①縮短序列長度，降低合成成本；②提升核酸適配體穩(wěn)定性，增強其應(yīng)用能力。基于以上目的，當前對核酸適配體序列進行優(yōu)化的方法主要包括截短優(yōu)化、裂分優(yōu)化及突變優(yōu)化等。

2.1 截短優(yōu)化

經(jīng)過SELEX技術(shù)從核酸文庫中篩選的能特異性結(jié)合靶標的核酸適配體全長一般在80 bp左右。近年來有很多研究表明，篩選得到的序列并不是全部參與靶標的結(jié)合，真正與靶標特異性結(jié)合的核苷酸通常不大于15個[31-32]。ZHOU等[33]研究發(fā)現(xiàn)，在某些條件下，當核酸適配體與靶標分子結(jié)合時，非必需核苷酸的存在將干擾這一過程的進行。ZHENG和GAO[34-35]等人研究表明，較短的核酸適配體序列具有更好的結(jié)合親和力與靶標特異性。CHINNAPPAN等人[16]將岡田酸（Okadaic Acid，OKA）適配體截短為兩個序列，一個標記為6-羧基熒光素（FAM），另一個標記有淬滅基團，構(gòu)建了OKA的熒光檢測方法。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，相較于全長適配體序列（Kd=526 nmol/L），截短后的核酸適配體具有更卓越的結(jié)合能力（Kd=2.77 nmol/L）。以上研究結(jié)果表明，采用截短優(yōu)化的方法有利于提高核酸適配體的識別與結(jié)合能力，降低序列合成成本，從而有利于開發(fā)更經(jīng)濟實惠的生物傳感器。

2.2 裂分優(yōu)化

2000年，STOJANOVIC等[36]首次報道將可卡因核酸適配體裂分成長度分別為16 bp和27 bp的兩條鏈，并成功構(gòu)建了三明治夾心型核酸適配體熒光生物傳感器，實現(xiàn)了可卡因的檢測。至此，裂分核酸適配體逐漸受到人們關(guān)注。水胺硫磷（ICP）作為一種廣譜性殺蟲、殺螨劑，因其高毒性作用被禁止用于蔬菜、部分果樹及中草藥等作物。LI等人[13]將長度為54 bp的水胺硫磷（ICP）核酸適配體裂分成24 bp和30 bp兩個片段，結(jié)合多壁碳納米管（MWCNT）和G四鏈體構(gòu)建了一種無酶、免標記的熒光檢測方法，該方法具有較強的選擇性和靈敏性，在最佳條件下檢測限達10 nmol/L。根據(jù)目前的報道，裂分型核酸適配體數(shù)量不多，在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用遠少于截短優(yōu)化，其中針對食品危害物核酸適配體本身的裂分方法更加有限。除了起步晚之外，其主要原因可能是適配體和靶標的結(jié)合機制尚未明晰，從而導致裂分成功率不高。

2.3 突變優(yōu)化

突變優(yōu)化主要是對核酸適配體上的單個或多個堿基進行化學修飾或堿基突變，以提高其穩(wěn)定性和結(jié)合性能。這種優(yōu)化方式常有助于理解并揭示核酸適配體與靶標分子的結(jié)合機制。SUN等人[21]對副溶血弧菌核酸適配體進行截短優(yōu)化后，發(fā)現(xiàn)CAGTGA組成的6堿基環(huán)狀結(jié)構(gòu)可能是靶標結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域，因此作者采用定點突變的方式對這部分序列進行優(yōu)化，當這部分序列被其他堿基取代后，適配體序列親和力大大降低，由此證明了這一結(jié)構(gòu)對危害物識別過程的重要性。

3 食品危害物截短核酸適配體生物傳感器應(yīng)用

生物傳感器是將專一性的生物感應(yīng)件元件與能夠產(chǎn)生和待測物濃度成比例的信號傳導器相結(jié)合的一種能實現(xiàn)對待測物進行定性或定量分析的裝置[37]。相對于其他類型生物傳感器，核酸適配體生物傳感器作為一種新興技術(shù)，具有更好的選擇性、靈敏度和穩(wěn)定性，在食品安全檢測領(lǐng)域的研究報道越來越多。根據(jù)其傳導信號的不同，可將其分為熒光適配體傳感器、比色適配體傳感器和電化學適配體傳感器等。

3.1 熒光適配體傳感器

熒光適配體傳感器是根據(jù)核酸適配體與待測物質(zhì)特異性結(jié)合產(chǎn)生的熒光信號而建立的一類傳感器。由于熒光的變化強度常常與待測物濃度成正比關(guān)系，因此可以對靶標進行定量測定。CHINNAPPAN等人[27]認為篩選獲得的核酸適配體序列其引物結(jié)合區(qū)可能不參與適配體/靶標復合物的形成，基于此，他們將蝦過敏原——原肌球蛋白（TM）適配體序列的兩端引物結(jié)合區(qū)序列截短去除，基于Mfold軟件預測的二級結(jié)構(gòu)設(shè)計了兩條長度分別為14 bp和25 bp的序列。然后將此兩條截短序列和母序列分別作為分子探針構(gòu)建了一種基于氧化石墨烯（GO）納米材料的熒光適配體傳感器。由于適配體與氧化石墨烯的共軛作用，熒光標記的核酸適配體被吸附在GO上時，熒光被猝滅，在沒有TM時，體系的熒光強度保持不變，當TM出現(xiàn)時，TM和核酸適配體特異性結(jié)合，將其從GO表面解離下來，熒光得到恢復，從而可以實現(xiàn)TM的檢測。研究結(jié)果表明，截短后獲得的長度為25 bp的序列其親和力比母核酸適配體提高了4倍，檢測限（LOD）可達2 nmol/L。該傳感器在使用TM加標的樣品中展現(xiàn)出良好的性能并實現(xiàn)了97%±10%的回收率，此外還具有選擇性好、檢測快速等優(yōu)點，在30 min內(nèi)即可完成檢測。

3.2 比色適配體傳感器

和熒光適配體傳感器相比，比色適配體傳感器具有實驗結(jié)果肉眼可見的特點，無需復雜設(shè)備即可完成對待測危害物的檢測。金納米顆粒（Au NPs）是最常用的比色法檢測的納米材料，由于其易于合成、修飾，已被廣泛用作比色適配體傳感器。TIAN等人[12]基于納米金構(gòu)建了農(nóng)藥殘留物啶蟲脒的比色適配體傳感器。他們從49 bp的核酸適配體序列中刪去多余的側(cè)翼核苷酸，獲得了43 bp、40 bp、37 bp和25 bp 4條序列。研究發(fā)現(xiàn)截短后的25 bp長的截短序列對啶蟲脒具有更好的親和力，隨后他們以此為基礎(chǔ)構(gòu)建了基于納米金的截短核酸適配體生物傳感器檢測方法，其靈敏度是母序列的3.5倍。

3.3 電化學適配體傳感器

電化學適配體傳感器是指將識別元件與靶標物質(zhì)的特異性結(jié)合轉(zhuǎn)化為電流信號的一類傳感器。常見的電化學分析技術(shù)有差分脈沖伏安法（DPV）、電化學阻抗法（EIS）、方波伏安法（SWV）、循環(huán)伏安法（CV）等，其中已報道的應(yīng)用于食品危害物檢測方面的方法較為有限。SVIGELJ等[28]將相應(yīng)的核酸適配體序列從40 bp截短優(yōu)化至長度僅為19 bp的短序列，并以此序列開發(fā)了一種夾心式的電化學傳感器，用于谷蛋白的檢測。研究結(jié)果表明，與原始母核酸適配體分子探針相比，這種以截短核酸適配體構(gòu)建的三明治式傳感器的檢測更加靈敏。

4 結(jié)語

由食品危害物導致的食源性疾病正嚴重危害著人們的身體健康，因此建立方便、快捷及靈敏的食品危害物檢測方法尤為重要。經(jīng)過序列優(yōu)化后的適配體具有良好的親和力、識別特性及選擇性，能夠在降低實驗成本的同時極大地提高檢測靈敏度，已被廣泛用于構(gòu)建熒光、比色、電化學等適配體傳感器。但核酸適配體的序列優(yōu)化仍有提升的空間，需要將核酸適配體構(gòu)效關(guān)系、作用機制等與序列優(yōu)化結(jié)合起來以提升優(yōu)化效果。同時，在核酸適配體生物傳感器方面，非標記型生物傳感器逐漸受到青睞，可能是今后重點發(fā)展的研究方向之一。相信在廣大科研工作者的不懈努力下，核酸適配體序列的優(yōu)化效率將會更高、技術(shù)更成熟，在食品安全檢測方面必將得到長足的應(yīng)用。