枳殼橙皮苷提取工藝研究

任嘉瑜，范 娜，彭曉邦

（1.商洛學院健康管理學院，陜西商洛 726000； 2.陜西“四主體一聯(lián)合”秦嶺健康食品配料及核桃產(chǎn)業(yè)技術(shù)校企聯(lián)合研究中心，陜西商洛 726000）

枳殼為蕓香科植物酸橙（Citurs aurantiumL.）及其栽培變種的干燥未成熟果實，盛產(chǎn)于江西、福建、陜西等地，富含黃酮類、揮發(fā)油、生物堿及香豆素等多種生物活性物質(zhì)，枳殼黃酮類物質(zhì)主要包括柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷和川橙皮素等[1-3]。其中橙皮苷具有抗菌消炎、抗腫瘤、降血壓、抗過敏、降低膽固醇及改變體內(nèi)酶活性等廣泛的藥理作用[3-6]。因此，本研究以商洛枳殼為研究對象，采用醇-堿提酸沉淀法，通過單因素和正交試驗，對枳殼中橙皮苷提取工藝進行優(yōu)化，以期為商洛枳殼的應(yīng)用擴展、經(jīng)濟價值的提升及實現(xiàn)枳殼經(jīng)濟產(chǎn)業(yè)化提供一定技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

商洛枳殼，采自商洛市；蘆丁橙皮苷對照品，購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司：無水乙醇，氫氧化鈉，鹽酸等均為分析純，購于天津科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HHS型電熱恒溫水浴鍋（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠出品）、高速萬能粉碎機（北京科偉永興儀器有限公司）、DHG-9132A電熱恒溫鼓風干燥箱（北京齊欣科學儀器有限公司）、H-2050R離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）、電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）、755B紫外可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司制造）。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 工藝流程

試驗流程：枳殼→干燥粉碎→水浴提取→過濾→濾液→酸沉→離心→沉淀→干燥→定容→測吸光度。

1.3.2 操作要點

（1）干燥粉碎。將枳殼在50 ℃干燥恒重，粉碎成粉末狀，每次稱取10.0 g，加入錐形瓶中。

（2）水浴提取與過濾。向錐形瓶中加入不同濃度的pH為13的乙醇溶液，在恒溫水浴鍋中進行提取，分別控制時間t，溫度T，然后靜止冷卻，過濾，棄去濾渣。

（3）酸沉。用2 mol/L HCl溶液調(diào)整濾液pH，直至pH為7，靜置過夜。

（4）離心與干燥。將酸沉后的濾液用離心機在4 000 r/min，離心5 min，棄去上清液，取出沉淀，然后用無水乙醇清洗沉淀，直至清洗液無色，然后在70 ℃恒溫干燥箱進行干燥，直至沉淀質(zhì)量不再發(fā)生變化[7-8]。

（5）定容和測吸光度值。準確稱取沉淀量為10 mg，用pH為13的堿性無水乙醇溶液完全溶解后，定容到100 mL的容量瓶中，在287 nm測定其吸光度值，并計算相應(yīng)的橙皮苷提取率。

1.3.3 枳殼橙皮苷提取工藝優(yōu)化

分別以乙醇濃度（50%、60%、70%、80%和90%）、料液比（1∶2、1∶4、1∶6、1∶8和1∶10）、提取時間（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h）、提取溫度（50 ℃、60 ℃、70 ℃、 80 ℃和90 ℃）、提取次數(shù)（1、2、3、4和5）為主要因素，pH為13的堿性乙醇為提取劑，研究各因素對枳殼橙皮苷提取效果的影響，并根據(jù)單因素實驗結(jié)果進行正交試驗。

1.3.4 標準曲線的繪制

精密稱取橙皮苷標準品10 mg，用pH為13堿性無水乙醇完全溶解，定容100 mL，得到濃度為100 μg/mL橙皮苷標準溶液。吸取0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL和6.0 mL標準溶液于10 mL試管中，用堿性乙醇稀釋到相應(yīng)的刻度線，在287 nm波長下測定不同濃度標準品吸光度值，以標準品的濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.5 橙皮苷提取率的計算

橙皮苷提取率為提取的橙皮苷的質(zhì)量與原料的質(zhì)量（干重）之比，則提取率可由計算公式獲得。計算公式：

式中：E-橙皮苷提取率；C-樣品濃度（μg/mL）；N-樣品稀釋倍數(shù)；V-待測樣液體積（mL）；M-原料的質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 橙皮苷標準曲線

橙皮苷標準曲線如圖1所示，得到回歸方程：y= 0.016 4x-0.002 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，橙皮苷濃度在10～60 μg/mL范圍內(nèi)濃度與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

圖1 橙皮苷標準曲線

2.2 單因素試驗結(jié)果分析

由圖2知，隨乙醇濃度的增大，橙皮苷提取率逐漸增加，當乙醇濃度為70%時，橙皮苷提取率達到最大。但繼續(xù)增加乙醇濃度，橙皮苷提取率反而降低。這可能是由于隨著乙醇濃度增大，不利于橙皮苷的溶出，從而使橙皮苷提取率下降。因此，確定乙醇濃度為70%。

圖2 乙醇濃度對橙皮苷提取率影響

由圖3可看出，隨料液比的增大，橙皮苷提取率逐漸增加，當料液為1∶6時，橙皮苷提取率達到最大。但繼續(xù)增加料液比，橙皮苷提取率反而降低。這可能是當料液比較小時，橙皮苷不能充分溶解，橙皮苷提取率較低，料液比過大時，相同溫度條件下需加熱更多液體，所以細胞內(nèi)部升溫緩慢，導致橙皮苷溶出緩慢，提取率降低。因此，確定料液比為1∶6。

圖3 料液比對橙皮苷提取率影響

由圖4可看出，隨提取時間的延長，橙皮苷提取率逐漸增大，當提取時間為3 h時，橙皮苷提取率最大。但繼續(xù)延長提取時間，橙皮苷提取率反而下降。這可能是因為提取 3 h時橙皮苷已充分溶解于溶劑中，當提取時間超過3 h，導致枳殼中其他醇溶性強、親脂性強的雜質(zhì)成分溶出，同時部分橙皮苷分解，導致橙皮苷提取率下降。因此，確定橙皮苷提取時間為3 h。

圖4 提取時間對橙皮苷提取率的影響

由圖5可看出，隨提取溫度升高，橙皮苷提取率逐漸增加，當提取溫度70 ℃時，橙皮苷提取率達到最大。但繼續(xù)升高溫度，橙皮苷提取率逐漸下降?？赡芴崛囟冗^高導致橙皮苷變性，膠狀物質(zhì)增加，同時，提取溫度過高，導致溶劑蒸發(fā)過快，且溫度繼續(xù)升高，成品顏色發(fā)黑，溶出的非橙皮苷成分增多，導致橙皮苷的提取率下降。因此確定提取溫度為70 ℃。

圖5 提取溫度對橙皮苷含量的影響

由圖6可看出，隨著提取次數(shù)的增加，橙皮苷提取率逐漸增加。但采用二次提取法提取效果增幅相對較高，之后增加提取次數(shù)，橙皮苷提取率變化并不明顯，綜合考慮提取時間和經(jīng)濟因素，確定提取次數(shù)為2次。

圖6 提取次數(shù)對橙皮苷提取率的影響

2.3 正交試驗結(jié)果分析

由單因素試驗結(jié)果得出乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取溫度（C）、提取時間（D）4個因素對橙皮苷提取率影響較大，因此采用正交試驗設(shè)計法得出的正交因素及水平如表1所示。由表2中正交試驗結(jié)果極差分析得出，對橙皮苷提取率影響順序依次為A（乙醇濃度）＞B（料液比）＞C（提取時間）＞D（提取溫度），因素D提取溫度對橙皮苷提取率影響較小，且驗證試驗結(jié)果表明提取工藝為A2B2C3D2，平均提取率為5.76%，因此從經(jīng)濟成本考慮，選擇水平1，最終確定最佳提取工藝組合為：A2B2C3D1，即乙醇濃度為70%，料液比為1∶6，提取時間為3.5 h，提取溫度為65 ℃，橙皮苷提取率為5.72%。

表1 正交試驗水平因素表

表2 正交試驗結(jié)果表

3 結(jié)論

本研究以商洛枳殼為原料，通過單因素試驗和正交試驗，優(yōu)化得到橙皮苷最佳提取工藝參數(shù)：乙醇濃度為70%、料液比為1∶6、提取時間為3.5 h、提取溫度為65 ℃，采用二次提取法，橙皮苷提取率為5.72%，該方法提取工藝簡單，重復性好，工藝穩(wěn)定。

醇-堿提酸沉淀法主要是利用橙皮苷在堿性條件開環(huán)溶解進行提取，在酸性條件下閉環(huán)形成沉淀。本研究通過單因素和正交試驗，對枳殼中橙皮苷提取工藝做了初步研究，較成功地提取得到了橙皮苷。本試驗采用乙醇的堿性溶液進行提取，不但環(huán)保、節(jié)能，而且提取率相對較高，適合工業(yè)生產(chǎn)。研究結(jié)果表明商洛枳殼中含有豐富的橙皮苷生物活性物質(zhì)，具有廣闊的開發(fā)利用前景和價值。