白藜蘆醇誘導癌細胞衰老機制的研究進展

馬鳳秋，高俊英，李國榮，謝英渤

(山東師范大學生命科學學院，山東濟南 250014)

癌癥是當前嚴重影響人類健康、威脅人類生命的主要疾病之一，大多數癌癥患者在經過一段時間的化療和放療后，除了產生致命的副作用外，還會對化療和放療產生耐藥性。細胞衰老是由應激引起的細胞周期阻滯狀態，通過誘導癌細胞衰老來抑制癌細胞的無限增殖被認為是一種新的癌癥治療策略。在一些癌前病變和良性腫瘤(如黑素細胞痣、肺腺瘤和前列腺上皮內瘤等)中都發現了大量的衰老細胞，但在相應的腫瘤惡化階段并未發現衰老細胞，表明細胞衰老可作為腫瘤發生的初始屏障[1-3]。2005年，Braig等[4]證明組蛋白甲基轉移酶Suv39h1介導的細胞衰老抑制了小鼠淋巴瘤的形成。隨后，在其他小鼠腫瘤模型(如HrasG12V誘導的乳腺癌和BRAFV600E誘導的肺癌)和多種人類癌癥中，也證明了細胞衰老對腫瘤的抑制作用[5-6]。在三陰性乳腺癌細胞中，胰島素樣生長因子結合蛋白7(insulin-like growth factor binding protein 7, IGFBP7)通過誘導DNA合成前期/合成后期(G1/G2期)細胞周期阻滯，上調磷酸化的p38絲裂原活化蛋白激酶(p-p38MAPK)及衰老相關蛋白p53、p21表達，誘導了癌細胞衰老并抑制了小鼠異種移植瘤的生長，而且IGFBP7的表達與乳腺癌進展和不良預后呈負相關[7-8]。一些化療藥物也通過誘導癌細胞衰老發揮抑癌功能，如：伊立替康和甲氨蝶呤通過促進脫氧核糖核酸(DNA)損傷誘導了結腸癌細胞等的衰老[9]；在肺癌患者中，卡鉑和紫杉醇治療促進了肺癌組織的衰老，抑制了腫瘤的生長[10]； 在乳腺癌患者中，蒽環類藥物和烷基化劑顯著上調了p16的表達，誘導了癌細胞衰老[11]。相比于誘導癌細胞凋亡，誘導癌細胞衰老治療劑量更小，在前列腺癌細胞中，濃度為250 nmol/L的阿霉素會導致凋亡，而濃度為25 nmol/L的阿霉素會誘導衰老[12-13]。使用小劑量的藥物對癌癥患者進行長期促衰老治療，能有效減少治療引起的毒副作用和耐藥性。

近年來，天然產物越來越多地用來預防和治療癌癥。白藜蘆醇(又名芪三酚)是一種天然非黃酮類多酚化合物，存在于70多種植物中，如葡萄、虎杖、花生等，具有抗氧化、抗炎、保護心臟的功能[14]，在抑制癌癥的發生、發展方面也顯示出良好效果，且對正常細胞無明顯毒性[15-16]。此外，白藜蘆醇可以逆轉癌細胞的多藥耐藥性，當與臨床藥物聯合作用時，可以使癌細胞對標準化療藥物敏感[17-18]。體內外研究顯示，白藜蘆醇能夠通過誘導癌細胞衰老發揮抑癌功能。本文中對細胞衰老的特征，以及白藜蘆醇通過氧化應激、癌基因激活、DNA損傷和其他機制誘導的癌細胞衰老的研究進展進行綜述。

1 細胞衰老的特征

細胞衰老是一種永久的細胞周期停滯狀態，包括復制衰老(replicative senescence, RS)和應激誘導的衰老(stress-induced premature senescence, SIPS)2種類型[19]。RS主要由端粒的縮短和功能障礙導致；SIPS可由氧化應激、活化的癌基因、DNA損傷試劑等誘導[20-21]。衰老細胞具有獨特的形態、結構和分子特征(見圖1)。在形態上，細胞骨架的重新排列使得衰老細胞變得扁平，體積增大；在結構上，衰老細胞會形成衰老相關異染色質灶(senescence-associated heterochromatin foci, SAHF)，通過抑制增殖相關基因表達，幫助建立和維持細胞周期阻滯[22]。核纖層蛋白B1(lamin B1)通常在衰老細胞中減少，它與衰老引起的細胞核結構變化有關[23]；衰老相關-β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase, SA-β-gal)是最常用的衰老細胞標志物，在衰老細胞的酸性溶酶體中SA-β-gal明顯增多，但在其他非分裂細胞如靜止細胞中缺乏高SA-β-gal活性[24]。細胞衰老通常還伴隨著細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases, CDK)抑制劑(包括衰老相關蛋白p16INK4a、p21CIP1和p27)表達水平的增加，其中p16INK4a的表達是已知最可靠的衰老標記，基于p16INK4a啟動子構建的報告基因已成功用于體內衰老細胞的檢測[25]。衰老相關蛋白p19ARF、p53在衰老細胞中表達增強，也可作為相關衰老生物標志物[23]。衰老細胞通常還表現為凋亡抗性，這可能與抗凋亡蛋白BCL2的高表達或p53的失活相關[26-27]。衰老細胞雖然喪失了增殖能力，但其代謝仍然非常活躍，可分泌炎性因子、趨化因子、細胞外基質蛋白酶和生長因子，稱之為衰老相關分泌表型(senescence-associated secretory phenotype, SASP)。SASP是衰老細胞病理功能的關鍵介質，可以通過旁分泌加速鄰近細胞的衰老[28]。

圖1 細胞衰老的特征

2 白藜蘆醇誘導癌細胞衰老的機制

2.1 氧化應激誘導的衰老

氧化應激理論由自由基理論發展而來，是促進細胞衰老最經典的機制之一。其中，活性氧(reactive oxygen species, ROS)的過量產生或清除不足引起的氧化應激是介導細胞衰老的主要因素。在人成纖維細胞中，外源性過氧化氫(H2O2)通過不可逆的細胞周期阻滯誘導了細胞衰老[29]。使用活性氧清除劑、過氧化氫酶或還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶-1(NADPH oxidases 1, Nox1)的小干擾核糖核酸(siRNA)處理人主動脈血管平滑肌細胞后，抑制了由血管緊張素Ⅱ誘導的衰老[30]。

在正常細胞和器官中，白藜蘆醇通過抑制氧化應激延緩衰老，減少年齡相關性疾病(如癌癥)的發生。Liang等[31]研究顯示，白藜蘆醇通過降低細胞內ROS水平和改善線粒體功能增強了小鼠卵母細胞對衰老的抵抗力。在D-半乳糖誘導的衰老小鼠模型中，白藜蘆醇處理抑制了心肌細胞和腦神經細胞的ROS水平，增強了肝臟抗氧化酶活性，從而提高了衰老小鼠心臟、腦和肝臟的器官指數[32]，而在癌細胞中，白藜蘆醇通過促進氧化應激誘導癌細胞衰老，從而發揮抑癌作用。白藜蘆醇長期處理導致結腸癌細胞HCT116呈現衰老樣生長停滯，這依賴于ROS誘導的p38MAPK、p53、p21的上調[33]。Luo等[34]發現白藜蘆醇通過上調Nox5的表達增加ROS水平，從而誘導肺癌細胞的衰老。在癌細胞U2OS和A549中，白藜蘆醇以劑量依賴的方式誘導DNA合成期(S期)阻滯，促進ROS產生，增加SA-β-gal表達[35]。

電離輻射(ionizing radiation, IR)也是誘導癌細胞衰老的一種重要方式。白藜蘆醇聯合IR處理肺癌細胞后的SA-β-gal陽性細胞比例明顯高于白藜蘆醇或IR單獨處理的，白藜蘆醇誘導的放射增敏與ROS的生成有關，抑制ROS的產生能夠減弱白藜蘆醇對肺癌細胞的輻射敏感性[36]。本課題組之前的研究顯示，白藜蘆醇處理癌細胞MDA-MB-231、MCF-7、H1299后，線粒體相關因子MT-ND1、MT-ND6、ATPase8、PGC-1α表達下調，ROS水平增高，衰老相關蛋白p21、p27等表達上調，SA-β-gal陽性染色增加[37]。在個體水平上，白藜蘆醇通過上調抗氧化酶活性，下調ROS和氧化損傷水平，延長了一年生魚貢氏假鰓鳉的壽命，并且抑制了其肝臟中自發性腫瘤的發生[38-39]。白藜蘆醇的抗氧化或促氧化特性及其對細胞衰老的生物學影響，可能因細胞和組織類型及特定環境而異，仍需進一步的研究。

2.2 癌基因誘導的衰老

1997年的一項研究發現，致癌基因ras通過激活p53或p16/視網膜母細胞瘤蛋白(Rb)信號通路來誘導鼠或人成纖維細胞衰老[40]，被稱為癌基因誘導的衰老(oncogene-induced senescence, OIS)。其他致癌基因如BRAF、Akt等的激活以及抑癌基因PTEN等的失活，也可誘發OIS[41]。C-X-C趨化因子受體2(C-X-C chemokine receptor 2, CXCR2)可正向調控OIS，白藜蘆醇能以時間依賴的方式顯著增加CXCR2轉錄水平，CXCR2的表達促進了癌細胞衰老[35, 42]。在OIS期間白細胞介素-6(interleukin-6, IL-6)表達上調，而缺失IL-6則使細胞重新進入細胞周期，恢復增殖并伴隨著SAHF形成減少CDK抑制劑p15INK4B表達下調[43]。肝癌缺失因子1(deleted in liver cancer 1,DLC1)是一種抑癌基因，其表達經常因基因缺失或異常啟動子甲基化在多種癌癥類型中失活或下調[44-45]。在肺癌和乳腺癌細胞中，白藜蘆醇顯著上調IL-6和DLC1的表達，并以DLC1依賴的方式誘導癌細胞衰老[37]。白藜蘆醇誘導了非小細胞肺癌的衰老，并伴隨著p-AKT表達的下調[36]。POZ/BTB與Krüppel(POK)家族中的成員POK紅系髓性致癌因子(POK erythroid myeloid ontogenic factor,Pokemon)，在膠質瘤細胞系U87MG、T98G、U251和原發性膠質母細胞瘤細胞中高表達，白藜蘆醇通過降低膠質瘤細胞中Pokemon啟動子活性和Pokemon表達，誘導細胞凋亡和衰老從而抑制癌細胞增殖[46]。

2.3 DNA損傷誘導的衰老

DNA損傷是細胞衰老的主要原因之一。當發生DNA單鏈或雙鏈斷裂時會觸發DNA損傷反應(DNA damage response，DDR)，DDR由DNA損傷蛋白傳感器如Mre-Rad50-Nbs-1(MRN)復合物介導，觸發共濟失調毛細血管擴張突變(ataxia telangiectasia mutated, ATM)和共濟失調毛細血管擴張Rad相關(ataxia telangiectasia and Rad3-related, ATR)蛋白激酶，細胞周期檢測點激酶1、激酶2(CHK1、CHK2)信號傳導系統，最終，DDR激活p53，p53通過轉錄激活其下游p21等靶點，促進細胞凋亡或衰老[47-48]。ATM、ATR在Ser139位點磷酸化組蛋白H2AX (γ-H2AX)，γ-H2AX常作為DNA雙鏈斷裂的標志，可以與復合物Rad51、BRCA1、53BP1、MRN等共定位于DNA斷裂處，參與DNA損傷修復[49-50]。

白藜蘆醇在DNA損傷誘導的癌細胞衰老中發揮重要作用。在骨肉瘤細胞中，白藜蘆醇通過上調ATM、CHK2誘導G2/細胞分裂期(M期)阻滯[51]；在結腸癌細胞中，白藜蘆醇誘導了瞬時的S期阻滯，激活了ATM/CHK1/細胞分裂周期2(cdc2)信號通路，上調了γ-H2AX、p-p53和p21的表達，并以ATM依賴的方式增加SA-β-gal陽性染色[33]。在前列腺癌細胞中，白藜蘆醇通過上調促凋亡分子Fas和TRAILR1促進了放射治療誘導的凋亡，也通過上調γ-H2AX促進了放射治療誘導的衰老[52]。Rad9蛋白是DDR的關鍵分子之一，具有腫瘤抑制作用，在MDA-MB-231和H1299細胞中，異位表達Rad9通過上調p21誘導了癌細胞衰老[53]。利用濃度為10～50 μmol/L的白藜蘆醇處理MCF-7和A549細胞后，SA-β-gal和γ-H2AX陽性染色細胞數量顯著增加，Rad9在轉錄和翻譯水平上的表達均增加，p53和p21表達上調，而用siRNA敲低Rad9后，顯著抑制了白藜蘆醇的上述作用[54]。白藜蘆醇誘導了肺癌細胞H460衰老，同時上調了p-CHK2、p53、p-p53的表達[36]。Ji等[37]研究顯示，小劑量白藜蘆醇(濃度為20 μmol/L)處理7 d或大劑量白藜蘆醇(濃度為100 μmol/L)處理1 d均顯著誘導了肺癌和乳腺癌細胞衰老，并且伴隨著p-CHK1表達上調。白藜蘆醇通過下調Rad51、Nbs-1、Mre-11、Rad50水平，維持γ-H2AX表達來阻止DNA損傷修復，從而增強乳腺癌細胞對順鉑的敏感性[55]。Rusin等[56]研究顯示，白藜蘆醇誘導的骨肉瘤細胞衰老樣生長抑制與BRCA1的上調相關。單泛素化的組蛋白H2B(mono-ubiquitination of histone H2B, uH2B)可以直接富集在DNA雙鏈斷裂區，參與DNA損傷修復[57]，大劑量白藜蘆醇短期處理(濃度為500 μmol/L，時間為4 h)可顯著抑制乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、腦腫癌細胞中uH2B水平，小劑量白藜蘆醇長時間處理(濃度為10～60 μmol/L，時間為9 d)通過下調uH2B將紡錘形膠質瘤細胞轉化為增大的、不規則的扁平細胞并表達SA-β-gal[58]。組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDAC)在多種癌癥中高表達，抑制HDAC減弱了癌細胞的DNA損傷修復能力，增強了癌細胞對放射治療的敏感性[59-60]。在神經膠質瘤細胞中，白藜蘆醇增強了HDAC抑制劑丁酸鈉的促衰老作用[61]。

2.4 其他機制誘導的衰老

白藜蘆醇介導的癌細胞衰老還與Rictor和SIRT1相關。Rictor是哺乳動物雷帕霉素靶復合物2(mTORC2)的一個組成部分，在人表皮樣癌細胞A431中，白藜蘆醇下調Rictor表達，導致Ras同系物家族成員A-鳥苷三磷酸酶(RhoA-GTPase)活性降低、肌動蛋白細胞骨架組織異常和自噬溶酶體形成受阻，從而抑制自噬過程誘導癌細胞衰老[62]。SIRT1是一種Ⅲ類煙酰胺腺嘌呤核苷酸(NAD+)依賴的組蛋白去乙酰化酶，在多種腫瘤模型中SIRT1可作為白藜蘆醇的關鍵靶點[15, 37]。在胃癌細胞AGS和MKN-45中，白藜蘆醇通過上調SIRT1誘導癌細胞衰老[63]。在胃癌細胞BGC-823和SGC-7901中，白藜蘆醇通過SIRT1介導的G1期阻滯、細胞周期蛋白D1 (cyclin D1)、CDK4、CDK6、p21和p16表達失調，誘導癌細胞衰老。白藜蘆醇對胃癌的抑制作用也在體內得到驗證。白藜蘆醇(每千克體質量每日劑量為40 mg)顯著降低了裸鼠腫瘤中細胞增殖標記物ki67陽性染色，增加了SA-β-gal陽性細胞比例，SIRT1的缺失則顯著減弱了白藜蘆醇在體內和體外的抑增殖和促衰老作用[64]。

3 展望

在過去的20年中，許多研究試圖找到細胞衰老與癌癥之間的相關性，結果普遍認為誘導癌細胞衰老可作為一個重要的抗癌策略。作為一種天然多酚和植物抗毒素，白藜蘆醇被認為是一種低毒、有效的抗癌化合物，可以通過調控氧化應激、癌基因激活和DNA損傷等相關信號通路誘導癌細胞衰老。關于白藜蘆醇的抗癌機制，有待從以下幾個方面進行深入探究：

1)白藜蘆醇生物利用度低，在體內會被迅速代謝，很難在血液中維持有效的治療水平，如何使其能在代謝前到達所需部位而發揮抗癌作用是一個重大的挑戰，研發出生物利用度高、靶向性強的新型白藜蘆醇將為癌癥治療帶來新的希望。

2)白藜蘆醇可以作為放射治療或化學療法增敏劑，與紫杉醇、替莫唑胺、辣椒素、阿霉素等聯合使用提高它們的抗癌作用，但作用機制仍需深入研究。

3)關于白藜蘆醇誘導癌細胞衰老的體內研究較少，利用更多的動物模型和臨床試驗來探究白藜蘆醇促衰老的機制將為癌癥治療提供重要依據。

總之，白藜蘆醇作為一種天然的抗癌化合物，在抗癌領域具有廣闊的應用前景。