維生素D受體基因多態性與青海地區藏族絕經后女性骨質疏松性骨折易感性的關系

鄭峰，王福榮，許喆

（青海省人民醫院骨科，青海西寧810007）

骨質疏松是老年女性常見的骨骼系統疾病，我國女性絕經后骨質疏松患病率為34.25%～39.20%[1-2]。骨質疏松容易導致骨折，使患者生活質量下降[3]。絕經后女性骨質疏松的發生是多因素共同作用的結果，包括年齡、遺傳、活動減少、營養失衡、維生素D 缺乏、吸煙、飲酒等[4]。維生素D是人類機體不可或缺的營養物質，主要通過作用于維生素D 受體（vitamin D receptor, VDR）發揮調控體內鈣、磷代謝的作用，與骨密度的變化密切相關[5]。近年來，VDR基因多態性對骨密度的影響倍受關注，研究證實VDR基因多態性與骨質疏松的發生以及抗骨質疏松治療反應性均有關[6-7]，且VDR基因多態性存在明顯的種族差異[8]。青海地區藏族女性生活在青藏高原中高海拔地區，與其他民族地理環境、生活習性、飲食習慣等均不相同，其VDR基因多態性是否與絕經后女性骨質疏松性骨折易感的相關性尚不清楚。鑒于此，本研究擬探討VDR基因多態性與青海地區藏族絕經后女性骨質疏松性骨折易感的相關性，并找出相關的VDR基因位點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年2月—2020年6月青海省人民醫院收治的205 例藏族絕經后女性骨質疏松性骨折患者作為觀察組。其中，年齡63～75 歲，平均（67.92±4.21）歲；閉經6～15年，平均（9.11±3.51）年；居住地：牧區83例，城鎮122例；吸煙85例；飲酒112例；運動水平：經常運動80 例、缺乏運動125 例；攝入足夠鈣制品75 例。納入標準：①經X 射線片或CT確診骨折；②T 值≤-2.5 或T 值> -2.5～< -1.0 但發生脆性骨折，符合2017 版《原發性骨質疏松癥診療指南》[9]中骨質疏松的標準；③青海地區常駐居民，無外地長期旅居史；④藏族絕經女性。排除標準：①交通事故、高空墜落、撞擊等暴力因素引起的骨折；②骨密度正常，T 值≥-1.0；③既往確診有小兒佝僂病、乙型肝炎病毒感染、結直腸癌；④漢族絕經女性。另選取同期于本院體檢的209 例藏族絕經后無骨質疏松女性作為對照組。對照組排除骨關節炎、風濕或類風濕疾病、骨腫瘤、骨結核等疾病。其中，年齡60～73 歲，平均（67.69±4.01）歲，停經5～14年，平均（9.06±3.35）年；居住地：牧區80 例，城鎮129 例；吸煙42 例；飲酒107 例；運動水平：經常運動146 例、缺乏運動63 例；攝入足夠鈣制品141 例。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，研究對象簽署知情同意書。

1.2 方法

研究對象入組后均采集外周靜脈血3 ml，應用Biomek NXP 核酸提取儀（美國貝克曼庫爾特公司）及配套試劑提取DNA，選擇吸光度（A260 nm/A280 nm）值在1.6～1.8，濃度> 50 ng/μl 的DNA 樣品待檢。Phusion?kit（美國Thermo 公司）擴增VDR基因，特異性正反向引物設計由上海英俊生物技術有限公司完成。Fok I位點正向引物：5'-GCCAGCTATGTAGG GCGAATC-3'，反向引物：5'-AAGTGAAAGCCAGTGGC TCG-3'，長度36 bp。Bsm Ⅰ位點正向引物：5'-CCCTCACTGCCCTTAGCTC-3'，反向引物 ：5'-GCTGAGCTCCCTGGTGGT-3'，長度24 bp。ApaⅠ位點正向引物：5'-CAGAGCATGGACAGGGAGCAA-3'，反向引物：5'-GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTC-3'，長度30 bp。TaqⅠ位點正向引物：5'-GGTGGGATTGAGC AGTGAG-3'，反向引物：5'-CTTCTGGATCATCTTGGCA TA-3'，長度20 bp。反應體系25 μl，含有60 ng 的DNA，正反向引物各1 μl，dNTPs（2 mmol/L）2.5 μl，加ddH2O 至25 μl。反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35 個循環，72℃繼續延伸5 min。1.2%瓊脂糖凝膠對PCR 擴增產物（10 μl）電泳30 min，溴化乙錠染色，采用FR-250 電泳儀（上海復日公司）分析掃描。SNaPshot 技術（美國應用生物公司）進行VDRBsmⅠ、ApaⅠ、TaqⅠ、FokⅠ位點多態性測定。

1.3 骨密度檢測

Prodigy 雙能X 射線骨密度儀（美國GE 公司）測定兩組腰椎（L2～L4前后位腰椎均值）、股骨頸、全髖的骨密度。

1.4 統計學方法

數據分析采用SHEsis 和SPSS 25.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗；計數資料以構成比表示，比較用χ2檢驗。影響因素的分析用Logistic 回歸模型。SHEsis 軟件進行Hardy-Weinberg 平衡檢驗，P>0.05 為符合遺傳平衡吻合度。相關性分析用Spearman 法。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組VDR基因多態性比較

兩組VDRBsmⅠ、FokⅠ、ApaⅠ、TaqⅠ位點基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg 平衡定律（觀察組P=0.619、0.705、0.802 和0.902；對照組P=0.768、0.892、0682 和0.781），具有群體代表性，可進行遺傳學分析。兩組BsmⅠ和FokⅠ位點基因型、等位基因分布比較，差異有統計學意義（P<0.05），兩組ApaⅠ和TaqⅠ位點基因型、等位基因分布比較，差異無統計學意義（P>0.05）（見表1）。Bsml 位點bb 基因型[=1.924（95% CI：1.735，2.203）]、Bb 基因型[=1.739（95% CI：1.602，1.867）]骨質疏松骨折患病風險度較BB 基因型明顯增加，b 等位基因[=2.521（95% CI：2.203，2.863）]骨質疏松骨折患病風險度較B等位基因明顯增加。FokⅠ位點ff 基因型[=1.903（95% CI：1.721，2.163）]、Ff 基因型[=1.541（95% CI：1.409，1.720）]骨質疏松骨折患病風險度較FF 基因明顯增加，f 等位基因[=2.021（95% CI：1.813，2.363）]骨質疏松骨折患病風險度較F等位基因明顯增加。

表1 兩組VDR基因多態性比較 例（%）

2.2 觀察組VDR BsmⅠ、FokⅠ、ApaⅠ、TaqⅠ位點不同基因型患者骨密度值比較

觀察組VDRBsml、FokⅠ位點不同基因型患者腰椎、股骨頸、全髖骨密度值比較，差異有統計學意義（P<0.05），ApaⅠ、TaqⅠ位點不同基因型之間腰椎、股骨頸、全髖骨密度值比較，差異無統計學意義（P>0.05）。VDRBsmⅠ位點BB 和Bb 基因型、FokⅠ位點FF 和Ff 基因型腰椎、股骨頸、全髖骨密度值大于bb 基因型和ff 基因型（P<0.05），VDR Bsml 位點BB 基因型與bb 基因型，FokⅠ位點FF 基因型與Ff 基因型之間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

表2 觀察組VDR BsmⅠ、FokⅠ、ApaⅠ、TaqⅠ位點不同基因型患者骨密度值比較 （g/cm2，±s）

表2 觀察組VDR BsmⅠ、FokⅠ、ApaⅠ、TaqⅠ位點不同基因型患者骨密度值比較 （g/cm2，±s）

注：?與bb基因型、ff基因型比較，P<0.05。

基因型BsmⅠBB Bb bb F 值P 值FokⅠFF Ff ff F 值P 值ApaⅠAA Aa aa F 值P 值TaqⅠTT Tt tt F 值P 值n 腰椎股骨頸全髖10 11 184 0.45±0.08?0.42±0.07?0.36±0.05 19.468 0.000 0.63±0.12?0.61±0.11?0.50±0.07 23.889 0.000 0.92±0.15?0.90±0.13?0.82±0.10 7.027 0.001 20 79 106 0.41±0.08 0.42±0.06?0.32±0.05?74.892 0.000 0.55±0.11 0.56±0.10?0.47±0.06?28.951 0.000 0.89±0.15 0.88±0.13?0.78±0.10?19.306 0.000 61 110 34 0.38±0.12 0.36±0.13 0.36±0.10 0.570 0.566 0.53±0.10 0.50±0.13 0.52±0.12 1.308 0.273 0.84±0.14 0.82±0.15 0.84±0.13 0.492 0.612 0.85±0.12 0.81±0.15 0.85±0.13 2.162 0.118 71 106 28 0.38±0.10 0.36±0.12 0.37±0.11 0.680 0.508 0.52±0.11 0.50±0.13 0.54±0.10 1.458 0.235

2.3 VDR BsmⅠ、FokⅠ、ApaⅠ、TaqⅠ位點基因型與骨密度值相關性分析

Spearman 相關性分析顯示，VDRBsmⅠ基因型、FokⅠ基因型與腰椎、股骨頸、全髖骨密度值呈負相關（P<0.05），ApaⅠ基因型、TaqⅠ基因型與腰椎、股骨頸、全髖骨密度值無相關性（P>0.05）。見表3。

表3 VDR BsmⅠ、FokⅠ、ApaⅠ、TaqⅠ位點基因型與骨密度值相關系數

2.4 影響青海地區藏族絕經后女性骨質疏松性骨折的Logistic回歸分析

以是否患有骨質疏松性骨折作為因變量（0 =否，1=是），以居住地（0=城鎮，1=牧區）、吸煙（0=否，1 =是）、飲酒（0 =否，1 =是）、運動水平（0 =經常運動、1=缺乏運動）、飲食習慣（0=攝入足夠鈣制品，1 =未攝入足夠鈣制品）、BsmⅠ位點多態性[0 =野生型（BB 基因型），1 =突變型（Bb+bb 基因型）]、FokⅠ位點多態性[0 =野生型（FF 基因型），1=突變型（FF+Ff 基因型基因型）]、ApaⅠ位點多態性[0 =野生型（AA 基因型），1=突變型（Aa+aa）]、TaqⅠ位點多態性[0 =野生型（TT 基因型），1 =突變型（Tt+tt基因型）]作為自變量，進行單因素Logistic 回歸分析。連續性變量直接代入方程未賦值，逐步法篩選變量（進入水準為0.05，排除水準為0.10）。結果顯示：吸煙、運動水平、飲食習慣、BsmⅠ位點多態性、FokⅠ位點多態性是青海地區藏族絕經后女性骨質疏松性骨折的危險因素（P<0.05）（見表4）。多因素Logistic 回歸結果顯示：未攝入足夠鈣制品[=1.223（95% CI：1.021，1.464）]、Bsml 位點多態性[=1.603（95% CI：1.870，1.997）]、FokⅠ位點多態性[=11.886（95% CI：1.169，1.764）]是青海地區藏族絕經后女性發生骨質疏松性骨折的危險因素（P<0.05）。見表5。

表4 青海地區藏族絕經后女性發生骨質疏松性骨折易感的單因素Logistic回歸分析參數

表5 青海地區藏族絕經后女性發生骨質疏松性骨折易感的多因素Logistic回歸分析參數

3 討論

女性絕經后卵巢功能衰竭，雌激素分泌量急劇下降，雌激素抑制破骨細胞的作用減弱，導致破骨細胞增殖，骨生成細胞凋亡，骨重建障礙，最終引起骨吸收增加，骨量流失，骨微結構改變，發生骨質疏松[10]。骨質疏松性骨折是導致老年女性殘疾和死亡的主要原因，對高危人群進行識別具有重要臨床意義。維生素D 是維持機體正常骨代謝的關鍵調節因子，VDR是維生素D 發揮生物學效應的核內生物大分子，位于12q13.1，長度> 100 kB，VDR基因在調節骨代謝和骨穩態中具有重要作用。1996年BERG 等[11]首次報道VDRBsml 多態性與絕經后女性骨礦物質密度有關。自此以后VDR多態性廣受關注，被視為探索導致骨質疏松癥遺傳因素的重要候選基因之一[12]。VDR基因多態性對應多個酶切位點，不同位點多態性對VDR 基因表達影響不同，目前研究較多的VDR位點是BsmⅠ、ApaⅠ、TaqⅠ、FokⅠ位點[13]。

Bsml 是VDR 基因多態性最重要的亞型之一，其多態性位于3'-非翻譯區，參與調節VDRmRNA的穩定性，目前關于VDR Bsml 位點多態性和骨質疏松癥易感性的研究多種多樣，但結果不一致[14]。張華等[15]指出廣東省中山地區絕經后女性的VDR基因型與骨密度之間存在顯著相關性，其中bb 基因型的骨密度最低，但Bsml 多態性與泰國絕經后骨質疏松的發生無明顯關系。本研究發現VDRBsmⅠ位點多態性與青海地區藏族絕經后女性骨質疏松性骨折易感有關，bb 是易感基因型。分析原因為VDRBsmⅠ位點基因突變可能影響VDR骨代謝調節功能，導致骨量的丟失。FokⅠ位于VDR的5'-端啟動區域第二個外顯子轉錄起始點，當T→C 轉變時可引起f 型VDR轉變為F 型VDR，由于F 位點所表達的VDR長度短于f 位點，因此其親和力、穩定性和轉運活力更強，更能促使胃腸道對鈣的吸收，增加骨密度[16-17]。本研究發現，觀察組VDRFokⅠ位點ff 基因型頻率高于對照組，ff 基因型骨密度低于對照組，回歸分析證實VDRFokⅠ位點多態性與青海地區藏族絕經后女性骨質疏松性骨折易感有關。TECHAPATIPHANDEE 等[16]發現FokⅠ位點基因多態性是泰國絕經后女性骨質疏松的易感因素。吳昌新等[18]發現VDRFokⅠ位點多態性與黎族老年骨質疏松的易感有關，Ff 基因型骨質疏松風險是FF基因者的1.13 倍，ff 基因型是FF 基因型的1.64 倍。分析VDRFokⅠ位點基因多態性可能通過影響維生素D 和鈣的吸收引起骨質疏松。

ApaⅠ位于VDR第8 個內含子，ApaⅠ位點多態性不影響VDR的氨基酸序列，但影響VDRmRNA 穩定性和蛋白質翻譯，與腸道鈣吸收受損有關[19]。本研究結果表明，VDRApaⅠ位點基因多態性與青海地區藏族絕經后女性骨質疏松性骨折無關，ApaⅠ位點基因型與骨密度無明顯關聯性。秦躍娟等[20]研究結果顯示上海市女性BMD 值變異無關聯。分析原因可能為VDRApaⅠ位點多態性與雌激素受體介導的成骨細胞骨代謝無關[21]。本研究也尚未觀察到VDRTaqⅠ位點多態性與青海地區藏族絕經后女性骨質疏松性骨折的相關性。一項薈萃分析報道也指出TaqⅠ位點基因型分布，等位基因分布與椎體骨折無明顯相關性[22]。

綜上所述，VDRBsmⅠ、FokⅠ位點多態性可能與青海地區藏族絕經后女性骨質疏松性骨折易感有關，BsmⅠ位點bb 和FokⅠ位點ff 是絕經后骨質疏松性骨折易感基因型。ApaⅠ、TaqⅠ位點多態性與青海地區藏族絕經后女性骨質疏松性骨折無明顯關聯。本研究局限之處在于樣本例數偏少，在以后研究中將進一步擴大樣本范圍和例數。