氯化鈉貯存大鼠皮膚抗原性的表達及活力研究

劉軍，王濤濤，侯明奎

（甘肅省人民醫院燒傷科，甘肅蘭州730000）

異體皮移植一直是搶救大面積燒傷患者的重要手段，但因其抗原性導致的免疫排斥反應，只能用作暫時性創面覆蓋物。為此，許多學者不斷尋找降低異體皮抗原性的方法，以增加或延長異體皮創面存活時間，為大面積燒傷患者的救治贏得更多機會。

低溫保存異體皮已成為燒傷外科對異體皮貯存常用方法。既往研究發現，低溫處理的異體皮移植成活時間明顯長于新鮮異體皮，但要求貯存的條件及成本較高[1]。2004年波蘭學者OLSZEWSKI等[2]首先將人體皮膚用氯化鈉處理后成功移植于裸鼠體表，在移植成功后的第3～4 周對裸鼠進行組織學觀察，發現移植的人體皮膚可長期存在于裸鼠體表而不被裸鼠皮膚取代。筆者也采用氯化鈉貯存異體皮并進行臨床小型創面的成功移植及修復，收到了與低溫保存異體皮進行移植的相似效果[3]。

人表皮所攜帶的HLA-DR 抗原及鼠類動物表皮存在的MHC-DR 抗原均為重要的移植抗原，在激發同種皮膚移植發生免疫排斥反應方面起著關鍵作用[4]。調控免疫反應的Ir基因亦位于MHC－D區，所以Ⅱ類抗原的基因亦具有相同的功能，可調控免疫反應的幅度[5-7]。其免疫病理現象是移植排斥反應、對疾病的反應過度或反應不足。臨床最常見的急性排斥反應主要由細胞免疫介導，皮膚移植排斥反應也主要是細胞免疫反應，此過程需要第一信號分子與第二信號協同刺激分子共同完成[8-10]。

為研究不同貯存條件下皮膚的抗原性，筆者以大鼠為實驗模型，選擇第一信號分子MHC-DR和第二信號協同刺激分子CD86 通過免疫組織化學染色對其抗原性進行對比，通過熒光染色法對大鼠皮膚活力進行對比，為氯化鈉替代液氮冷凍方法處理異體皮降低皮膚抗原性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SPF 級SD 大鼠30 只[實驗動物生產許可證：SCXK（甘）2011-0001，實驗動物使用許可證：SYXK（甘）2013-0002]，體重（206±18）g，由蘭州大學實驗動物中心提供。

1.2 試劑及儀器

氯化鈉（純度99%）購自江蘇鹽城制藥廠，MHC-DR 單克隆抗體、CD86 單克隆抗體、免疫組織化學SP 試劑盒購自福州邁新生物工程公司，SYTO 13 核酸染料、GoldViewI 核酸染料購自上海北諾生物科技有限公司。

TP1020 脫水機購自德國萊卡公司，YABO BMJ-400 組織包埋機購自常州中威電子有限公司，MICROM 315 切片機購自德國萊卡公司，YABO 200 漂烘片機購自常州中威電子有限公司，BX51顯微鏡、BX53 熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯株式會社。

1.3 動物分組及模型復制

將健康雄性SPF 級SD 大鼠隨機分為氯化鈉制備組、液氮制備組和新鮮皮膚組，每組10 只。

氯化鈉制備組：在大鼠背側脊柱旁設計一2 cm×3 cm 矩形創面進行脫毛，長軸與脊柱平行。在局部麻醉下注射體積分數1%普魯卡因，在脫毛區域中間切取1 cm×1 cm 大小全層皮膚，生理鹽水漂洗后直接置入氯化鈉（純度99%）中貯存，室溫貯存時間3 個月。液氮制備組：其他同氯化鈉制備組，切取皮膚經抗凍液處理后置于液氮中貯存3 個月。新鮮皮膚組：在3 個月時，同上述方法切取大鼠皮膚，各組分別進行MHC-DR、CD86 檢測及組織活力檢測[11-14]。

1.4 免疫組織化學檢測

氯化鈉制備組和液氮制備組組織塊進行復蘇后與新鮮皮膚組組織塊用10%甲醛固定，石蠟包埋，連續切片。按免疫組織化學試劑盒說明書進行MHC-DR、CD86 檢測，其中一抗1∶100 稀釋，另用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）代替一抗作作為陰性對照。陽性判斷標準：以胞膜或/和胞漿著棕色作為陽性染色。高倍鏡下（400 倍）隨機選取5 個視野，根據著色程度和陽性細胞率進行評分。每份標本進行3 次檢測，計算均值。著色程度評分：無色計0 分，黃色計1 分，棕色計2 分，深棕色計3 分；陽性細胞評分：<10%計0 分，10%～< 30%計1 分，30%～< 50%計2 分，≥50%計3 分。兩者之和作為大鼠評分[15-16]。

1.5 組織活力檢測

采用SYTO/EB 活力測定法檢測，氯化鈉制備組和液氮制備組組織塊進行復蘇后與新鮮皮膚組組織塊進行冷凍切片，撈片后PBS洗3次，3 min/次，滴加SYTO 13 工作液50 μl（1 μmol/L），37℃避光孵育20 min，PBS 洗3 次，3 min/次。滴加GoldViewI工作液50 μl（1 μg/ml）在冰浴中避光30 min，PBS洗3 次，3 min/次。在488 nm/ 520 nm 激發，熒光顯微鏡觀察。活細胞發綠色熒光，死細胞發紅色熒光。記數后計算出組織細胞活力程度[17-20]。

1.6 統計學方法

數據分析采用SPSS 13.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組皮膚MHC-DR、CD86抗原表達水平比較

各組MHC-DR、CD86 抗原表達水平比較，差異有統計學意義（P<0.05），液氮制備組與氯化鈉制備組MHC-DR 抗原表達水平處于中等水平，且氯化鈉制備組較液氮制備組低（P>0.05），新鮮皮膚組MHC-DR 抗原表達水平處于高水平表達，且較液氮制備組與氯化鈉制備組高（P<0.05），氯化鈉制備組與液氮制備組CD86 抗原表達水平均處于低水平表達，且氯化鈉制備組較液氮制備組低（P>0.05），新鮮皮膚組CD86 抗原表達水平處于高水平表達，且較液氮制備組與氯化鈉制備組高（P<0.05）。見表1和圖1～3。

表1 各組皮膚的MHC-DR、CD86CD86抗原表達水平比較 （n=10，±s）

表1 各組皮膚的MHC-DR、CD86CD86抗原表達水平比較 （n=10，±s）

組別液氮制備組氯化鈉制備組新鮮皮膚組F 值P 值CD86 2.47±0.71 2.26±0.49 4.41±0.55 36.668 0.000 MHC-DR 2.71±0.44 2.58±0.56 4.70±0.40 62.834 0.000

圖1 CD86免疫組織化學染色 （×400）

圖2 MHC-DR免疫組織化學染色 （×400）

圖3 SYTO/EB熒光染色 （×400）

2.2 各組皮膚活力值比較

液氮制備組、氯化鈉制備組和新鮮皮膚組的皮膚活力值分別為（67.2±5.5）%、（65.4±3.2）%和（95.4±4.5）%，經方差分析，差異有統計學意義（F=98.361，P=0.000），液氮制備組與氯化鈉制備組在3 個月時其組織活力均超過半數，但兩者比較差異無統計學意義（P>0.05），新鮮皮膚組較液氮制備組與氯化鈉制備組高（P<0.05）。

3 討論

異體皮在大面積燒傷患者的救治中及小面積創面治療中均起重要作用[20-23]，但異體皮的最佳貯存方式一直是使用液氮冷凍貯存，既往有研究顯示，經過液氮貯存異體皮的組織活力較高[24]。且經過此方式處理的異體皮的抗原性明顯減弱，有助于延長異體皮移植后的存活時間[25]，從而更好地起到對創面覆蓋與修復作用。眾所周知，液氮貯存異體皮臨床應用成本較高，且過程相對繁瑣，因此，筆者選用氯化鈉貯存異種皮與液氮貯存異種皮進行抗原性及組織活力的對比研究，希望能尋找一種新的、簡便易行的皮膚貯存方式，又能使保存的皮膚起到與液氮貯存的皮膚相似的作用，此項研究國內外尚無相關報道。

本研究中通過免疫組織化學法對氯化鈉貯存異種皮、液氮貯存異種皮及新鮮異種皮抗原性進行檢測，新鮮異種皮MHC-DR、CD86 抗原表達最強，且與前兩種貯存方式的異種皮在MHC-DR、CD86 抗原表達在統計學上有顯著差異，從而也證實了既往研究中發現低溫處理的異體皮移植成活時間明顯長于新鮮異體皮的觀點。同時本研究中，氯化鈉與液氮貯存異種皮MHC-DR、CD86 抗原表達在統計學上無差異，兩種不同的異種皮貯存方式均可以減弱皮片的抗原性，是否有利于延長異體皮移植后皮片的存活時間還需要進一步臨床研究。本研究中應用熒光染色法對氯化鈉、液氮貯存異種皮及新鮮異種皮的組織活力進行檢測，新鮮異種皮的組織活力最高。氯化鈉和液氮貯存異種皮的組織活力較低，與新鮮異種皮的組織活力有顯著差異，但氯化鈉和液氮貯存異種皮的組織活力相近，兩者在統計學上無差異。

綜上所述，氯化鈉貯存異種皮簡便、易行，可成為替代液氮貯存異種皮的一種新方法。今后研究中，筆者將進一步改進方法，進行氯化鈉處理異體皮的臨床研究，進一步降低異體皮的抗原性，更好地服務于臨床。