優(yōu)良本土戴爾有孢圓酵母的篩選及其在冰葡萄酒釀造中的應用

齊白羽，洪夢楠，陳譽文，李 婧

（錦州醫(yī)科大學 食品科學與工程學院，遼寧 錦州 121000）

冰酒是典型的甜類葡萄酒，1794年起源于德國，距今已有200多年的歷史，因其優(yōu)越的感官品質被譽為“葡萄酒皇后”[1]。優(yōu)質冰酒的生產需要以經過-8 ℃自然冷凍的冰葡萄為原料[2]，經低溫度采摘與壓榨后接種酵母，并在15～17 ℃下進行低溫發(fā)酵[3]。近年來，我國冰酒產業(yè)迅速發(fā)展，遼寧桓仁地區(qū)因其適宜的溫度與獨特的環(huán)境，成為我國最大的冰酒產區(qū)，而威代爾是該地區(qū)生產冰酒的主要冰葡萄品種[4]。

酵母在冰酒發(fā)酵過程中的作用至關重要，但冰葡萄汁中高濃度的糖、酸以及SO2易為酵母營造不利的生長環(huán)境，因此篩選具備良好耐受性能的優(yōu)良冰酒酵母菌株是必要的[5]。酵母分為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和非釀酒酵母（non-Saccharomyces cerevisiae）。釀酒酵母在葡萄酒自然發(fā)酵過程中可以將葡萄汁中的糖轉化為乙醇、二氧化碳與其他代謝產物。然而，接種一些獨特的非釀酒酵母菌株作為發(fā)酵劑，可以提高葡萄酒的質量與穩(wěn)定性，有效增加葡萄酒的香氣復雜度[6]。相關研究表明，與釀酒酵母相比，非釀酒酵母具有高產β-葡萄糖苷酶的能力，該酶可以促進葡萄果實中C13-降異戊二烯類、單萜烯、倍半萜醇和脂肪醇等糖苷結合態(tài)香氣物質的釋放[7-8]。戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）是釀酒中常見的非釀酒酵母之一，其在具有產酶能力的同時，還可在含高濃度糖的葡萄酒中產生低含量的乙酸、乙醛和高含量的果味酯和萜烯類香氣化合物[9-10]，并減少異味副產物的產生[11]。

因此，本研究以威代爾冰酒自然發(fā)酵過程中分離出的10株戴爾有孢圓酵母菌株為研究對象，對其葡萄糖、酒精、酸、SO2耐受性能及產β-葡萄糖苷酶性能進行測定分析，篩選發(fā)酵性能優(yōu)良的酵母，并將篩選菌株與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）ST混合發(fā)酵冰葡萄汁，并對冰葡萄酒的基本理化指標進行測定，以期為獲得可應用于冰葡萄酒釀造的優(yōu)良本土戴爾有孢圓酵母提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

威代爾冰葡萄汁：于2017年12月采集自遼寧省五女山米蘭酒業(yè)有限公司（北緯41°17′53.53″、東經125°22′27.26″）。理化指標：pH值為4.03，總糖含量為432.97 g/L，可滴定酸（以酒石酸計）含量為4.98 g/L。

1.1.2 菌株

本土戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）菌株（編號為TD1、TD2、TD3、TD4、TD5、TD6、TD7、TD8、TD9、TD10）：分離自威代爾冰酒的自然發(fā)酵前期[12]，保存于錦州醫(yī)科大學食品科學與工程學院實驗室；商業(yè)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）ST：法國Laffort公司。

1.1.3 試劑

葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；柑橘果膠、對硝基苯酚、氯霉素（均為分析純）：北京索萊寶生物科技有限公司；熊果苷、木聚糖、檸檬酸鐵銨（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技有限公司；生理鹽水、酒石酸、亞硫酸、酒精（均為分析純）：天津科密歐化學試劑有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

無氨基酵母氮源（yeastnitrogenbase withoutaminoacids，YNB）培養(yǎng)基：青島海博生物有限公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基[5]：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母提取物10 g/L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。YPD固體培養(yǎng)基：YPD液體培養(yǎng)基中添加瓊脂20 g/L。

β-葡萄糖苷酶活性篩選培養(yǎng)基[13]：YNB培養(yǎng)基6.7 g/L、熊果苷5 g/L、瓊脂20 g/L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。滅菌后添加2%質量分數(shù)為1%的檸檬酸鐵銨溶液。

誘導培養(yǎng)基[13]：YNB培養(yǎng)基10 g/L、木聚糖2%，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基[14]：酵母浸粉5 g/L、酸水解酪蛋白5 g/L、葡萄糖50 g/L、磷酸二氫鉀0.55 g/L、氯化鉀0.425 g/L、氯化鈣0.125 g/L、硫酸鎂0.125 g/L、氯化鐵0.002 5 g/L、硫酸錳0.002 5 g/L、溴甲酚綠0.022 g/L、瓊脂17 g/L、pH值5.5，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

pHS-3C型精密酸度計：上海虹益儀器儀表有限公司；SW-CJ-2FD凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；YSQ-LS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱：金壇市鑫鑫實驗儀器廠；TG16KII臺式高速離心機：濟南福的機械有限公司；M4-AL204型電子分析天平：蘭州中西儀器有限公司；ND-1000微量紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；LC-15C型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：島津企業(yè)管理（中國）有限公司；GC-9790Plus氣相色譜（gas chromatography，GC）儀：浙江福立分析儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化

將受試酵母菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基，于28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)48 h，使各菌液的細胞濃度達到107CFU/mL（OD600nm=1.0），之后稀釋10倍，獲得細胞濃度為106CFU/mL的酵母菌稀釋液作為種子液，備用。

1.3.2 菌株耐受性的測定

為考察菌株對葡萄糖、乙醇、酸及SO2的耐受性，將酵母種子液按5%（V/V）的接種量分別接種于含不同質量濃度葡萄糖（300 g/L、350 g/L、400 g/L、450 g/L、500 g/L）[15]、不同體積分數(shù)乙醇（4%、8%、10%、12%、14%）[16]、不同質量濃度酒石酸（4 g/L、8 g/L、12 g/L、16 g/L、20 g/L）[17]和不同質量濃度SO2（100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L、350 mg/L）[18]的YPD液體培養(yǎng)基中，于28 ℃條件下靜置培養(yǎng)48 h后，使用紫外可見分光光度計在波長600 nm處測定吸光度值，試驗重復3次。

1.3.3 菌株產β-葡萄糖苷酶性能的測定

定性分析：將酵母菌種子液稀釋10倍后涂布于β-葡萄糖苷酶活性篩選培養(yǎng)基上，于28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)5 d，具有β-葡萄糖苷酶活性的菌株周圍會產生深棕色的水解圈[19]。

定量分析：按5%的接種量將酵母種子液接種于YPD培養(yǎng)基中，28 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h后，11 000×g離心10 min，收集酵母細胞。以106CFU/mL的接種量接種于誘導培養(yǎng)基，28 ℃條件下靜置培養(yǎng)48 h，11 000×g離心10 min后，分別收集酵母菌細胞和上清液。采用0.2 mol/L檸檬酸-0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 5.0）洗滌兩次酵母菌細胞后重懸，用于細胞壁上β-葡萄糖苷酶活性的測定；而上清液則用于細胞外β-葡萄糖苷酶活性的測定[20]。

1.3.4 冰葡萄汁發(fā)酵試驗

在250 mL無菌三角瓶中，裝入180 mL冰葡萄汁后加入50 mg/L SO2，70 ℃加熱20 min，于18 ℃條件下靜置發(fā)酵30 d，每隔24 h稱質量，連續(xù)3 d質量恒定代表發(fā)酵結束。共進行3組發(fā)酵試驗，分別設置2個混菌發(fā)酵處理組，1個純種發(fā)酵處理組，每組試驗重復3次。其中，在混菌發(fā)酵組中，分別于葡萄汁中接種篩選出的戴爾有孢圓酵母菌TD6與TD9，48 h后順序接種釀酒酵母ST，且初始接種量均為106CFU/mL。在純種發(fā)酵組中只接種釀酒酵母ST。

1.3.5 冰葡萄汁發(fā)酵過程中酵母菌發(fā)酵速率變化

在冰酒的發(fā)酵過程中，每隔24 h稱質量以監(jiān)測CO2的質量損失[21]。

1.3.6 冰葡萄汁發(fā)酵過程中酵母菌的生長情況

分別在每組冰葡萄汁發(fā)酵過程中的第0天、2天、4天、7天、14天、21天和30天取樣，經生理鹽水適當稀釋后涂布于WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，于28 ℃條件下靜置培養(yǎng)5 d[12]。根據(jù)不同菌落顏色和形態(tài)[16]的區(qū)別，分別對戴爾有孢圓酵母與釀酒酵母進行菌落計數(shù)。

1.3.7 冰葡萄酒基本理化指標的測定

冰葡萄汁發(fā)酵結束后取樣，測定冰葡萄酒的基本理化指標。

總糖含量的測定：參考國標GB/T 15038—2006《葡萄酒果酒分析方法》；酒石酸、乙酸含量的測定：采用HPLC法[21]；乙醇含量的測定：采用GC法[22]。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

對試驗所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2007進行基本處理和作圖，試驗均重復3次，結果以“平均值±標準偏差”表示；使用SPSS17.0進行Duncan檢驗和單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 菌株的耐受性

10株本土戴爾有孢圓酵母菌對葡萄糖、乙醇、酒石酸及SO2的耐受性見圖1。

圖1 10株本土戴爾有孢圓酵母菌對葡萄糖、乙醇、酒石酸及SO2的耐受性測定結果Fig.1 Determination results of tolerance to glucose,ethanol,acid and SO2 of 10 strains of Torulaspora delbrueckii

由圖1可知，隨著葡萄糖、乙醇、酒石酸以及SO2含量的升高，大部分戴爾有孢圓酵母菌株的OD600nm值呈下降趨勢。根據(jù)國標GB/T 25504—2010《冰葡萄酒》的規(guī)定，冰酒的酒精度在9.0%vol～14.0%vol、乙酸質量濃度≤2.1 g/L、葡萄糖質量濃度≥125 g/L。除了菌株TD2外，所有戴爾有孢圓酵母菌株均可以耐受質量濃度為500 g/L的葡萄糖，體積分數(shù)為4%的乙醇，質量濃度為20 g/L的酒石酸以及質量濃度為350 mg/L的SO2；尤其是戴爾有孢圓酵母菌株TD3、TD4、TD6、TD7、TD8及TD10可以耐受體積分數(shù)為8%的乙醇。綜上可知，除菌株TD2外，其他所有的受試戴爾有孢圓酵母菌株均能夠耐受冰酒發(fā)酵過程中高糖、高酸環(huán)境以及一定體積分數(shù)的乙醇，具有應用于冰酒發(fā)酵的潛力。

2.2 菌株的β-葡萄糖苷酶活性分析

2.2.1 定性分析

10株戴爾有孢圓酵母菌株的β-葡萄糖苷酶活性的定性分析結果見表1。

表1 10株戴爾有孢圓酵母菌株產β-葡萄糖苷酶的定性分析結果Table 1 Qualitative analysis results of β-glucosidase produced by 10 strains of Torulaspora delbrueckii

由表1可知，10株菌株中只有戴爾有孢圓酵母菌株TD3、TD4、TD6、TD7、TD9、TD10具有β-葡萄糖苷酶活性。因此，對初步篩選出具有β-葡萄糖苷酶活性的6株戴爾有孢圓酵母菌株進行酶活性定量分析。

2.2.2 定量分析

β-葡萄糖苷酶可分布于細胞外、細胞內和細胞壁上。發(fā)酵過程中，在酵母不發(fā)生自溶的情況下，通常僅有細胞外的酶有能力作用于香氣前體物質并產生香氣。在發(fā)酵前期，大部分酵母細胞易懸浮于發(fā)酵液中，因此細胞壁結合酶對葡萄酒香氣物質的釋放也會產生一定的積極作用[13]。

由圖2可知，6株戴爾有孢圓酵母菌株均具有細胞外及細胞壁上的β-葡萄糖苷酶活力。其中，戴爾有孢圓酵母菌株TD3、TD6、TD9及TD10細胞壁上的β-葡萄糖苷酶活力明顯優(yōu)于菌株TD4與TD7，尤其是菌株TD6與TD9，其細胞壁上的酶活力分別高達23.21 U/mL與31.13 U/mL。此外，相對于菌株TD3、TD4、TD10，菌株TD6與TD9還具備相對較高的細胞外β-葡萄糖苷酶活性，分別為2.835 U/mL和4.635 U/mL。綜上可知，菌株TD6和TD9具備良好的產細胞外以及細胞壁上β-葡萄糖苷酶的能力，因此，將菌株TD6和TD9應用于冰葡萄酒釀造。

圖2 6株戴爾有孢圓酵母菌株產β-葡萄糖苷酶的定量分析結果Fig.2 Quantitative analysis results of β-glucosidase produced by 6 strains of Torulaspora delbrueckii

2.3 冰葡萄汁混菌發(fā)酵

2.3.1 冰葡萄汁混菌發(fā)酵過程中酵母菌株發(fā)酵速率的變化

由圖3可知，3個發(fā)酵組均能夠在30 d內完成酒精發(fā)酵，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液中的CO2質量損失變化趨勢一致。混菌發(fā)酵組TD6/ST與TD9/ST在發(fā)酵過程中CO2的質量損失顯著低于純種發(fā)酵組ST（P＜0.05），這說明戴爾有孢圓酵母的接種會對酒精發(fā)酵速率產生一定的負面影響。然而，HRANILOVIC A等[23]研究發(fā)現(xiàn)，非釀酒酵母參與的混合發(fā)酵可以在保證發(fā)酵及時完成的前提下，通過提高葡萄酒的品質來彌補其發(fā)酵速率相對緩慢的問題，此外，控制相對平緩的發(fā)酵速率不僅可以提高香氣代謝物的保留率，還可以有效節(jié)約能源，以防止發(fā)酵劇烈損壞容器[24]。

圖3 冰葡萄汁混菌發(fā)酵過程中酵母菌發(fā)酵速率的變化Fig.3 Change of yeast fermentation rate during mixed fermentation of ice-grape juice

2.3.2 冰葡萄汁混菌發(fā)酵過程中酵母菌的生長情況

由圖4可知，在混菌發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時間的延長，釀酒酵母ST的菌體濃度均呈先上升趨勢，直到第14天菌體濃度分別達到最大值，菌體濃度對數(shù)值分別為7.48與7.20，隨后，菌體濃度開始下降直至發(fā)酵結束。混菌發(fā)酵過程中釀酒酵母ST的菌體濃度均低于純種發(fā)酵，說明戴爾有孢圓酵母菌株的加入對釀酒酵母ST的生長有一定的抑制作用。在混菌發(fā)酵過程中，菌株TD6與TD9的菌體濃度也先呈增長趨勢，且均于第4天達到最大值，菌體濃度對數(shù)值分別為7.5與7.6。然而，在釀酒酵母ST接種48 h后，它們的菌體濃度迅速下降，甚至在發(fā)酵結束時不能被檢測到。此外，兩個混菌發(fā)酵組中釀酒酵母ST的細胞濃度均在第14天超過了戴爾有孢圓酵母TD6與TD9，同時，釀酒酵母ST開始逐漸占據(jù)各自發(fā)酵過程中的主導地位。針對戴爾有孢圓酵母細胞濃度早期下降的現(xiàn)象，可能與發(fā)酵過程中釀酒酵母與非釀酒酵母之間營養(yǎng)物質的競爭或細胞間的接觸機制有關[21，25]。

圖4 冰葡萄汁發(fā)酵過程中酵母菌TD6（A）及TD9（B）的生長情況Fig.4 Growth of yeast TD6 (A) and TD9 (B) during fermentation process of ice-grape juice

2.3.3 冰葡萄酒基本理化指標的測定結果

過高的乙酸含量不僅不利于冰酒香氣產生，還會降低冰酒的品質。由表2可知，與釀酒酵母ST的純種發(fā)酵相比，接種兩株戴爾有孢圓酵母可以明顯降低乙酸的含量（P＜0.05），這與ALBERGARIA H等[26-27]的研究結果一致。與菌株TD9相比，菌株TD6降低乙酸含量的效果更好。此外，混菌發(fā)酵組冰酒中總糖含量更高，而酒精度較低，這與CO2質量損失的動態(tài)變化一致。3組冰酒中乙酸含量均＜2.10 g/L，均符合國標GB/T 25504—2010《冰葡萄酒》的規(guī)定，這表明將篩選出的兩株優(yōu)良戴爾有孢圓酵母菌株TD6、TD9應用于冰葡萄酒釀造，具有高度可行性。

表2 冰酒的基本理化指標測定結果Table 2 Determination results of basic physical and chemical indexes of icewine

3 結論

10株戴爾有孢圓酵母菌中除菌株TD2外，其他菌株均能夠耐受葡萄糖500 g/L、乙醇體積分數(shù)4%、酒石酸16 g/L及SO2350 mg/L，其中菌株TD6與TD9產β-葡萄糖苷酶活力較高，為優(yōu)良本土戴爾有孢圓酵母。將菌株TD6、TD9分別與釀酒酵母ST混合發(fā)酵冰葡萄汁時均能在30 d完成酒精發(fā)酵，且冰葡萄酒的基本理化指標均符合國標GB/T 25504—2010《冰葡萄酒》規(guī)定。此外，戴爾有孢圓酵母的接種對整個發(fā)酵過程的發(fā)酵速率與釀酒酵母的生長起到了一定的抑制作用，并且可以降低冰葡萄酒中乙酸和乙醇含量，提高總糖含量。