優良耐酸釀酒酵母的篩選及發酵特性研究

耿海波

（石家莊職業技術學院 食品與藥品工程系，河北 石家莊 050081）

酵母是一類包括釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和非常規酵母在內的能發酵糖類的多種單細胞真核微生物的總稱，主要分布在偏酸性含糖量較高的環境中[1]，其中釀酒酵母是工業生產中重要的微生物類群，它們可合成的天然產物超過100種[2]，廣泛應用于食品、醫藥保健、輕工、能源化工和生命科學等多個領域，尤其是在發酵食品和啤酒、葡萄酒等酒精類產品的發酵方面具有重要的作用[3]，現如今全世界酒精年產量已超過一億t[4]。

釀酒酵母在發酵過程中，尤其是在果酒生產中，經常會遇到強酸性、高糖、高酒精環境，這對酵母的耐酸性能提出了很高的要求。目前，國外科研工作者通過基因重組技術以獲取耐酸性較強且產量高的釀酒酵母[5-6]，但是基因重組技術獲得的耐酸性能不夠穩定。國內研究人員通常選擇傳統的篩選方法對釀酒酵母進行選育，同時對釀酒酵母耐酸機理展開研究[7]，并將其應用于白酒和果酒的生產[8-10]。獲得的釀酒酵母對于糖的利用能力、酒精生產能力、高糖和高酒精環境耐受性能等方面雖然有了很大的進步[11-12]，但是對于耐酸性的高產菌株篩選工作仍有待進一步深化。

本研究采用酸性選擇培養基、氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，TTC）顯色法、杜氏小管發酵法從實驗室保藏的87株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中篩選出耐酸性強的優良菌株，并測定其最適生長條件、耐受性及發酵性能，以期為后續果酒釀造工作研究提供優質的菌種[13-14]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

87株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）（編號為SC-1～SC-87）：為前期研究利用皂素廢水發酵酒精時篩選并保存于本實驗室的具有一定耐酸性的實驗菌株[15]。

1.1.2 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeastextractpeptonedextrose，YPD）培養基[16]：酵母浸粉10.0 g，蛋白胨20.0 g，溶于900 mL蒸餾水中，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min；另取葡萄糖20.0 g溶于100 mL蒸餾水中，115 ℃高壓蒸汽滅菌15 min后與上述溶液混勻，pH自然。如配制固體培養基另加入20.0 g瓊脂粉。

WL營養瓊脂（wallerstein laboratory nutrient agar，WL）培養基[17]：酵母浸粉4.0 g，蛋白胨5.0 g，KH2PO40.55 g，KCl 0.425 g，CaCl20.125 g，MgSO4·7H2O 0.125 g，FeCl30.002 5 g，MnSO40.002 5 g，瓊脂粉20.0 g，加入溴甲酚綠22.0 mg，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min；另取葡萄糖50.0 g溶于100 mL蒸餾水中，115 ℃高壓蒸汽滅菌15 min后與上述溶液混勻，pH自然。

TTC培養基[18]：TTC上層培養基：葡萄糖0.5 g，瓊脂粉15.0 g，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，待冷卻后加入TTC 0.5 g。TTC下層培養基：蛋白胨10.0 g，酵母浸粉7.5 g，KH2PO45.0 g，MgSO4·7H2O 2.0 g，檸檬酸1.35 g，氨芐青霉素1.0 g，瓊脂粉30.0 g，溶于900 mL蒸餾水中，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min；另取葡萄糖50.5 g溶于100 mL蒸餾水中，115 ℃高壓蒸汽滅菌15 min后與上述溶液混勻，pH 4.0。

1.1.3 主要試劑

酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂粉、乳酸、無水乙醇、KH2PO4、KCl、CaCl2、MgSO4·7H2O、FeCl3、MnSO4、NaCl：國藥集團化學試劑有限公司；溴甲酚綠：上海源葉生物科技有限公司；氨芐青霉素：北京索萊寶科技有限公司。實驗所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設備

YJ-VS-1型單人垂直超凈工作臺：無錫一凈凈化設備有限公司；LDZX-50L型高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；DHP-9602電熱恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；BS-2E型恒溫振蕩培養箱：常州恒隆儀器有限公司；UV-1900i型紫外-可見分光光度計：島津企業管理（中國）有限公司；ME204型電子分析天平、FE22型pH計：梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司；PAL-1糖度儀：廣州市愛宕科學儀器有限公司；A8964酒精計：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 釀酒酵母菌株的活化

在無菌環境下分別挑取實驗室保藏的87株釀酒酵母，接種到YPD固體斜面培養基上，于28 ℃培養24 h；挑取上述菌株移接入100 mL YPD液體培養基中，于28 ℃靜置培養24 h；再移接入100 mL YPD液體培養基中，于28 ℃、160 r/min振蕩培養24 h作為種子液，備用。

1.3.2 優良耐酸釀酒酵母菌株的篩選

用乳酸調節YPD液體培養基pH值為2.0，按5%（V/V）的接種量接入釀酒酵母種子液，于28 ℃、160 r/min振蕩培養24 h后，取菌懸液劃線于WL固體培養基，于28 ℃恒溫培養24 h，挑取生長狀況較好的典型的單菌落，接種到YPD固體斜面保藏，用于后續篩選[19]。

TTC顯色法篩選[20-21]：用接種環挑取釀酒酵母菌株在TTC下層培養基表面連續劃線，于28 ℃培養48 h，將融化并冷卻至45～50 ℃的TTC上層培養基倒入TTC下層培養基表面，于28 ℃培養3 h后，觀察培養基顯色情況，從中篩選出產酒精能力較強的菌株。

杜氏小管發酵法篩選[22]：取0.5 mL釀酒酵母種子液于裝有10 mL YPD液體培養基的試管中，倒置放入杜氏小管，并避免杜氏小管內有氣體存在，密封后于28 ℃靜置培養，每隔12 h觀察并記錄杜氏小管內產氣情況，篩選出生長和發酵性能較好的菌株。

1.3.3 優良耐酸釀酒酵母菌株生長特征的測定

最適生長溫度：按5%（V/V）的接種量將釀酒酵母種子液接種于100mLYPD液體培養基中，分別于不同溫度（22℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃）、160 r/min條件下振蕩培養，每組平行三份，以不加菌的YPD液體培養基為對照，培養24 h后使用紫外-可見分光光度計在波長600 nm處測定菌液的OD600nm值。

最適生長pH值：用乳酸調節YPD液體培養基的pH值為3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0，按5%（V/V）的接種量將釀酒酵母種子液接種于100 mL不同pH值的YPD液體培養基中，在最適溫度、160 r/min條件下振蕩培養，每組平行三份，培養24 h后測定菌液的OD600nm值。

生長曲線的測定[23]：按最適pH值配制YPD液體培養基，按5%（V/V）的接種量將釀酒酵母種子液接種于100 mL YPD液體培養基中，在最適溫度、160 r/min條件下振蕩培養，每組平行三份，每2 h取樣測定菌液的OD600nm值，以發酵時間（x）為橫坐標，OD600nm值（y）為縱坐標繪制生長曲線。

1.3.4 優良耐酸釀酒酵母菌株耐受性的測定

乙醇耐受性測定：按體積比在YPD液體培養基中加入6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%無水乙醇，按5%（V/V）的接種量將釀酒酵母種子液接種于100 mL YPD液體培養基中，在最適培養環境下培養48 h后測定菌液的OD600nm值。

鹽耐受性能測定[24]：在YPD液體培養基中加入NaCl，使培養基中NaCl含量為10 g/L、30 g/L、50 g/L、70 g/L、100 g/L、150 g/L、200 g/L，按5%（V/V）的接種量將釀酒酵母種子液接種于100 mL YPD液體培養基中，在最適培養環境下培養一周，并觀察菌株是否有生長。

糖耐受性能測定[24]：調整YPD液體培養基中葡萄糖的質量濃度分別為200 g/L、300 g/L、400 g/L、500 g/L、600 g/L，按5%（V/V）的接種量將釀酒酵母種子液接種于100 mL YPD液體培養基中，在最適培養環境下培養一周，并觀察菌株是否有生長。

1.3.5 優良耐酸釀酒酵母菌株發酵性能的測定[25]

按5%（V/V）的接種量將釀酒酵母種子液接種于100 mL YPD液體培養基中，稱質量后在最適培養條件下振蕩培養，每24 h稱一次質量，按國家標準GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定發酵力、總糖、總酸、揮發酸含量及酒精度。

1.3.6 數據分析

采用Excel 2019對數據進行整理和作圖，數據結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 優良耐酸釀酒酵母菌株的篩選

2.1.1 釀酒酵母菌株耐酸性能的測定

從87株釀酒酵母中篩選得到5株耐酸性能較好的釀酒酵母菌株，分別為菌株SC-6、SC-15、SC-19、SC-55、SC-62，其生長情況見表1。

表1 釀酒酵母菌株耐酸性能的測定結果Table 1 Determination results of acid tolerance of Saccharomyces cerevisiae strains

2.1.2 釀酒酵母菌株產酒精能力的測定

5株釀酒酵母菌株的產酒精能力見表2。由表2可知，菌株SC-6、SC-15、SC-62的產酒精能力相對較強。

表2 5株釀酒酵母菌株產酒精能力的測定結果Table 2 Determination results of alcohol production capacity of 5 Saccharomyces cerevisiae strains

2.1.3 釀酒酵母菌株產氣能力的測定

5株釀酒酵母菌株的產氣情況見表3。

表3 5株釀酒酵母菌株產氣能力的測定結果Table 3 Determination results of gas production capacity of 5 Saccharomyces cerevisiae strains

由表3可知，菌株SC-15和SC-62的產氣能力最強，在24 h時已經使杜氏小管中充有一半氣體，在36 h時杜氏小管中已經充滿CO2氣體。結合TTC顯色實驗結果，故選擇菌株SC-15和SC-62為優良耐酸釀酒酵母菌株。

2.2 優良耐酸釀酒酵母菌株的生長特征

2.2.1 最適生長溫度的測定結果培養溫度對釀酒酵母SC-15和SC-62生長的影響見圖1。

圖1 培養溫度對兩株釀酒酵母菌株的影響Fig.1 Effects of culture temperature on 2 Saccharomyces cerevisiae strains

由圖1可知，釀酒酵母SC-15和SC-62均在28 ℃時生長最好，OD600nm值達到最大，分別為1.80和1.89。菌株SC-62在26～32 ℃的范圍內OD600nm值均高于菌株SC-15，尤其是在30 ℃時，菌株SC-62的OD600nm值與28 ℃時變化不明顯，呈現出更強的溫度適應能力。綜上，菌株SC-15和SC-62的最適生長溫度均為28 ℃，且菌株SC-62的溫度適應能力更強。

2.2.2 最適生長pH值的測定結果

培養基初始pH對釀酒酵母SC-15和SC-62生長的影響見圖2。

圖2 初始pH值對兩株釀酒酵母菌株的影響Fig.2 Effects of initial pH value on 2 Saccharomyces cerevisiae strains

由圖2可知，pH值變化對兩株菌生長的影響存在差異，菌株SC-15在初始pH值為3.8～4.8之間生長良好，有較寬的pH值適應范圍，其最適pH值為4.4，而菌株SC-62在初始pH值為3.6～4.4之間生長旺盛，最適pH值為4.0。在pH值3.0～4.2范圍內，菌株SC-62的OD600nm值高于菌株SC-15，說明菌株SC-62具備更強的耐酸特性。綜上，菌株SC-15和SC-62的最適生長pH值分別為4.4、4.0，且菌株SC-62具備更強的耐酸特性。

2.2.3 生長曲線的測定結果

釀酒酵母SC-15和SC-62的生長曲線見圖3。

圖3 兩株釀酒酵母菌株的生長曲線Fig.3 Growth curves of 2 Saccharomyces cerevisiae strains

由圖3可知，兩株釀酒酵母菌株的生長規律類似，菌株SC-15在發酵0～14 h時生長速度較慢，為延滯期；在發酵14～22 h時進入迅速生長的對數期，之后進入穩定期。與菌株SC-15相比，菌株SC-62的延滯期相對更短，在第12小時時進入對數期，達到穩定期后的OD600nm值也稍高。在生產中延滯期短的菌株適應能力更強，可在短時間內形成數量優勢，減少染菌機會同時減少副產物的形成，并有利于提高發酵效率。

2.3 優良耐酸釀酒酵母菌株的耐受性

2.3.1 耐乙醇性能的測定結果

釀酒酵母SC-15和SC-62的耐乙醇性能見圖4。

圖4 兩株釀酒酵母菌株耐乙醇性能的測定結果Fig.4 Determination results of alcohol tolerance of 2 Saccharomyces cerevisiae strains

由圖4可知，乙醇體積分數在6%～8%時，兩株釀酒酵母生長狀況均良好；當乙醇體積分數＞12%之后，兩株菌株受到較大的抑制，OD600nm值急劇下降；當乙醇體積分數＞16%之后，兩株菌株的OD600nm值與剛接種時相同，說明釀酒酵母在此環境中被完全抑制。與菌株SC-15相比，菌株SC-62的耐乙醇性能較好，且優于李彥芹等[24-25]研究菌株的耐受性。

2.3.2 耐鹽性能測定結果

釀酒酵母SC-15和SC-62的耐鹽性能見表4。

表4 兩株釀酒酵母菌株耐鹽性能的測定結果Table 4 Determination results of salt tolerance of 2 Saccharomyces cerevisiae strains

由表4可知，兩株釀酒酵母均能在NaCl質量濃度≤70g/L的YPD液體培養基中生長，當NaCl質量濃度為100 g/L時，菌株SC-62仍可生長，可見菌株SC-62具有良好的耐鹽性能。

2.3.3 耐糖性能測定結果

釀酒酵母SC-15和SC-62的耐糖性能見表5。

表5 兩株釀酒酵母菌株耐糖性能的測定結果Table 5 Determination results of sugar tolerance of 2 Saccharomyces cerevisiae strains

由表5可知，菌株SC-15在葡萄糖質量濃度≤400 g/L的YPD液體培養基中生長，而菌株SC-62具有相對更好的耐糖性能，可在葡萄糖質量濃度≤500 g/L的YPD液體培養基中生長。

2.4 優良耐酸酵母菌株發酵性能測定結果

釀酒酵母SC-15和SC-62的發酵性能見表6。

表6 兩株釀酒酵母菌株發酵性能的測定結果Table 6 Determination results of fermentation performance of 2 Saccharomyces cerevisiae strains

由表6可知，菌株SC-62具有更高的發酵力[5.93 g CO2/（100 mL·24 h）]，高于楊寬等[25]的研究結果，說明此菌株能充分利用培養基中的糖轉化為酒精，發酵后酒精度達到7.55%vol，達到了用于果酒發酵的要求，產生的揮發酸含量（0.61 g/L）也低于國標GB 15037—2006《葡萄酒》中規定的葡萄酒中揮發酸含量≤1.2 g/L的限值，綜合性能優于菌株SC-15，相比實驗室保存的原有菌株，菌株SC-62具備更好的耐酸、耐糖性能，同時具有延滯期短、可適應較寬的溫度范圍等優點，發酵力強，具備一定的應用價值[15]。

3 結論

本研究采用酸性選擇培養基、TTC顯色法、杜氏小管發酵法從實驗室保藏的87株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中篩選得到2株耐酸性強的優良菌株，其中菌株SC-62綜合性能優于菌株SC-15，最適生長溫度、pH分別為28 ℃、4.0，可耐受乙醇體積分數14%、NaCl 100 g/L、葡萄糖500 g/L，具有發酵力[5.93 g CO2/（100 mL·24 h）]強，酒精產量（7.55%vol）高，延滯期（12 h）短、適應性強等優點。