構建ADH2和THI3基因敲除釀酒酵母用于降低糯米酒中高級醇的研究

吳 亮，陳文穎，閆統帥，周世水

（華南理工大學 生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006）

糯米酒是中國歷史悠久的特色飲料酒[1]，糯米作為主要發酵原料，經過浸米、蒸飯、酒曲糖化和發酵等步驟釀制而成[2]，因其富含蛋白質、氨基酸、維生素和多糖多肽等營養物質，深受人們的喜愛[3-4]。高級醇是糯米酒中重要的呈香呈味物質[5]，合適的高級醇濃度可以顯著改善糯米酒的品質和風味[6-7]，然而高級醇濃度過高時，會給酒體帶來苦味和異雜味，也是糯米酒容易使人上頭的原因之一[8]。

高級醇俗稱雜醇油，是三個及以上碳原子一價醇類的總稱[9]。糯米酒中的高級醇主要包括異戊醇、異丁醇、正丙醇和β-苯乙醇，它們都是釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）次級代謝副產物[10]。釀酒酵母中高級醇的合成主要包括兩條代謝途徑[11]：氨基酸分解途徑（Ehrlich途徑）和生物合成途徑。Ehrlich途徑中，支鏈氨基酸經過轉氨反應形成α-酮酸，然后α-酮酸經脫羧和脫氫反應形成高級醇[12]。生物合成途徑中，糖代謝形成的丙酮酸經三羧酸循環（tricarboxylic acid cycle，TCA）形成α-酮酸，再經過脫羧和脫氫形成相應的高級醇[13]。

釀酒酵母ADH2基因編碼的乙醇脫氫酶參與了高級醇合成過程的脫氫步驟，它與其他高級醇合成相關基因協同提高異丁醇、異戊醇[14]和β-苯乙醇的生成量[15-16]，而敲除ADH2基因對糯米酒高級醇生成量的影響研究甚少。THI3基因編碼的類丙酮酸脫羧酶被鑒定為亮氨酸代謝的主要脫羧酶，它催化2-酮異己酸形成異戊醇[17]。STYGER G等[18]通過敲除釀酒酵母THI3基因，導致主要高級醇的生成量都下降。

本研究構建了ADH2和THI3基因敲除的單倍體重組酵母，再雜交成重組雙倍體酵母，應用于糯米酒發酵來研究ADH2和THI3基因敲除對高級醇生成的影響，為降低糯米酒中高級醇的含量提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質粒

本實驗所用菌株和質粒如表1所示。

表1 本實驗所有菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids used in the study

1.1.2 主要試劑

安琪白酒曲：安琪酵母股份有限公司；ApexHF HS脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶、DNA回收純化試劑盒、質粒小量提取試劑盒：湖南艾科瑞生物科技有限公司；遺傳霉素（G418）、博來霉素（Zeocin）：北京普博欣生物科技有限責任公司；引物：上海生工生物工程有限公司合成；酵母提取粉、蛋白胨、瓊脂（均為生化試劑）：廣東環凱微生物科技有限公司；乙酸丁酯、正丙醇、異丁醇、異戊醇、β-苯乙醇（均為色譜純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；半乳糖、無水乙酸鈉、氯化鉀、氯化鈉、酒石酸鉀鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉、3,5-二硝基水楊酸（均為分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.1.3 主要培養基[19]

Luria-Bertani（LB）培養基：氯化鈉10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L。

浸酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養基：葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母浸粉10g/L。

半乳糖誘導培養基（yeast extract peptone galactose，YEPG）：半乳糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母提取粉10 g/L。

麥氏（McClary）產孢培養基：葡萄糖0.1%，氯化鉀0.18%，無水乙酸鈉0.82%，酵母提取粉0.25%，瓊脂2%。

所有固體培養基在液體培養基的基礎上添加2%瓊脂，并都需115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

T100聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）基因擴增儀、PowerPac 3000電泳儀、Gel Doc2000凝膠成像分析系統：美國Bio-Rad公司；5804R高速臺式冷凍離心機：德國Eppendorf公司；GC8100氣相色譜儀（gaschromatography，GC）：滕州中科普儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設計

根據美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）GenBank數據庫中釀酒酵母（S.cerevisiae）S288c基因組序列，采用Primer 5.0軟件設計聚合酶鏈式反應（PCR）引物見表2。

表2 本實驗使用的引物Table 2 Primers used in the study

1.3.2 基因敲除組件的構建

ADH2基因敲除組件構建：以DC-S和DC-A為引物，質粒PUG6為模板，擴增得到KanMX抗性基因片段（1 703 bp，loxp-KanMX-loxp片段）。以酵母基因組作為模板，分別用引物對ADH2-E/ADH2-F和ADH2-G/ADH2-H合成ADH2基因上游同源臂AU（165 bp）和下游同源臂AD（185 bp）。再用融合PCR方法將三個片段連接成ADH2基因敲除組件AUloxp-KanMX-loxp-AD（1 957 bp）。

THI3基因敲除組件構建：以THI3-R和THI3-T為引物，質粒PUG6為模板，擴增得到KanMX抗性基因片段（1 767bp，loxp-KanMX-loxp片段）。以酵母基因組作為模板，分別用引物對THI3-E/THI3-F和THI3-G/THI3-H合成THI3基因上游同源臂TU（299 bp）和下游同源臂TD（256 bp）。利用融合PCR將三個片段連接成THI3基因敲除組件TU-loxp-KanMXloxp-TD（2 244 bp）。

1.3.3 重組酵母菌株的構建

（1）重組單倍體酵母菌株的獲得

本研究采用電轉化法[20]，將ADH2基因敲除組件轉化到酵母菌XF1a7和XF1α6，通過同源重組獲得重組菌XF1a7-AK和XF1α6-AK。通過含200 μg/mL G418抗生素的YEPD平板篩選陽性轉化子，并進行PCR驗證。然后利用Cre/loxP重組系統去除KanMX抗性標記，將Cre重組酶表達載體PSH65質粒轉化到XF1a7-AK和XF1α6-AK中，YEPG培養誘導Cre表達并切除KanMX抗性標記。再通過傳代的方式使PSH65質粒丟失，最終獲得ADH2基因缺失的重組菌XF1a7-A和XF1α6-A。基因敲除過程如圖1所示。

圖1 ADH2和THI3基因敲除過程Fig.1 Knockout process of gene ADH2 and THI3

類似地，將THI3基因敲除組件轉化到XF1a7-A和XF1α6-A中，篩選獲得XF1a7-ATK和XF1α6-ATK，最終得到ADH2和THI3雙基因缺失的酵母菌XF1a7-AT和XF1α6-AT。

（2）重組雙倍體酵母菌株的構建

通過不同配型重組單倍體酵母的雜交得到重組雙倍體酵母菌[21]。首先，將菌株接種到10 mL YEPD液體培養基中30 ℃活化培養12～16 h，然后各取1 mL a型和α型單倍體酵母菌液接種到3 mL YEPD培養基中培養雜交24 h，用顯微鏡觀察雜交情況，并將雜交菌液涂布到YEPD平板中培養2 d，挑取較大的菌落劃線到產孢培養基中26 ℃培養5～7 d，若能產生孢子則為雜交成功的重組雙倍體酵母菌株。

1.3.4 生長曲線的繪制

挑取一環酵母菌接種到10 mL YEPD液體培養基中，30 ℃搖床培養24 h。再將菌液按2%的比例接種到100 mL YEPD液體培養基中，30℃搖床培養，每2h取樣測波長600nm的吸光度值（OD600nm值）。以OD600nm值為縱坐標，時間為橫坐標繪制生長曲線。

1.3.5 發酵試驗

從試管斜面取一環酵母菌接種到10 mL YEPD液體培養基中，30 ℃搖床培養24 h后，取2 mL菌液接種到含18 mL YEPD液體培養基的50 mL錐形瓶中，30 ℃搖床培養16 h，得到種子液。

取40 g糯米、100 mL水加入250 mL燒杯中，浸泡2 h，蒸飯后冷卻，加入10 mL種子液、0.8 g酒曲，攪拌均勻，30 ℃發酵4 d。

1.3.6 樣品處理

發酵糯米酒過濾酒液，測定其還原糖，另取100 mL濾液和100 mL水到1 000 mL蒸餾燒瓶中蒸餾出100 mL酒液，測定酒精度和高級醇含量。

1.3.7 分析方法

CO2釋放量采用稱質量法測量[22]、殘留還原糖用3,5-二硝基水楊酸法測定[23]、酒精度用酒精計法測定[24]，高級醇等揮發性物質通過氣相色譜內標法測定[25]，內標為乙酸丁酯，氣相色譜相關參數如下：

色譜柱為LZP-930白酒分析毛細管柱（25 m×0.53mm×1.0 μm）；高純氮氣（N2）為載氣，載氣流速30 mL/min；柱箱的升溫程序為50 ℃保持5 min，以10 ℃/min的速度升溫至200 ℃，保持5 min。檢測器溫度230 ℃，氫氣流速30 mL/min，空氣流速300 mL/min，尾吹氮氣速度30 mL/min；進樣口溫度220 ℃，進樣體積0.4 μL。

2 結果與分析

2.1 重組酵母菌株的構建和驗證

按照1.3.3的方法構建重組菌株，陽性轉化子菌株通過PCR驗證，分別用引物ADH2-A/ADH2-D（基因兩端驗證引物）、ADH2-A/B-M（上游驗證）和C-M/ADH2-D（下游驗證）對重組單倍體酵母菌株進行PCR驗證，結果見圖2。由圖2可知，XF1a7的基因兩端驗證、上游驗證、下游驗證的結果分別為1 557 bp、無條帶、無條帶，XF1a7-AK的基因兩端驗證、上游驗證、下游驗證的結果分別為2 057 bp、882 bp、1 020 bp，XF1a7-A的基因兩端驗證、上游驗證、下游驗證的結果分別為550 bp、無條帶、無條帶，PCR驗證條帶和預期一致，因此成功獲得ADH2基因敲除的單倍體酵母菌。

圖2 重組單倍體酵母菌株XF1a7-AK、XF1a7-A的PCR驗證Fig.2 PCR verification of recombinant haploid yeast strains XF1a7-AK and XF1a7-A

對ADH2敲除菌進行THI3基因的敲除，陽性轉化子分別用PCR引物對THI3-A/THI3-D（基因兩端驗證引物）、THI3-A/B-M（上游驗證）和C-M/THI3-D（下游驗證）進行PCR驗證，結果見圖3。由圖3可知，XF1a7-A的基因兩端驗證、上游驗證、下游驗證的結果分別為1 897 bp、無條帶、無條帶，XF1a7-ATK的基因兩端驗證、上游驗證、下游驗證的結果分別為2 355 bp、1 067 bp、1 133 bp，XF1a7-AT的基因兩端驗證、上游驗證、下游驗證的結果分別為848 bp、無條帶、無條帶，PCR驗證條帶和理論一致，因此成功獲得ADH2和THI3雙基因敲除的單倍體酵母菌株。

圖3 重組單倍體酵母菌株XF1a7-ATK、XF1a7-AT的PCR驗證Fig.3 PCR verification of recombinant haploid yeast strains XF1a7-ATK and XF1a7-AT

根據1.3.3的方法，通過XF1a7-A和XF1α6-A雜交得到重組雙倍體XF1-A，XF1a7-AT和XF1α6-AT雜交得到重組雙倍體XF1-AT，結果見圖4。由圖4可知，許多啞鈴型細胞，即為單倍體雜交過程形態。菌株XF1-A和XF1-AT的產孢驗證見圖5。由圖5可知，XF1-A和XF1-AT都能產生孢子，說明XF1-A和XF1-AT都是成功雜交的雙倍體酵母菌。

圖4 重組單倍體的雜交過程形態Fig.4 Morphology of hybridization of recombinant haploid

圖5 重組雙倍體酵母的產孢驗證Fig.5 Verification of sporulation of recombinant diploid yeast

2.2 雙倍體重組菌的生長性能

根據1.3.4的方法，繪制原始酵母XF1、重組雙倍體酵母XF1-A和XF1-AT的生長曲線，結果見圖6。由圖6可知，重組菌XF1-A的生長曲線和原始菌XF1幾乎相同，雙基因缺失酵母XF1-AT的前期的生長速率略微低于菌株XF1，但是最終生物量都沒有顯著差異。這表明ADH2和THI3雙基因缺失對酵母菌體生長性能影響不大。

圖6 重組菌和原始菌XF1的生長曲線Fig.6 Growth curves of recombinant strains and original strain XF1

2.3 ADH2和THI3基因敲除對糯米酒高級醇生成的影響

重組雙倍體酵母菌株和原始菌發酵糯米酒高級醇生成量見圖7。

圖7 重組菌和原始菌XF1高級醇生成量Fig.7 Higher alcohols production of recombinant strains and original strain XF1

由圖7可知，菌株XF1-A的總高級醇生成量為522.16 mg/L，比菌株XF1降低11.16%（P＜0.05），其中異丁醇、異戊醇和β-苯乙醇分別降低12.08%、11.32%和16.31%。菌株XF1-AT的高級醇生成量最低，為462.03 mg/L，比菌株XF1降低21.39%，其中正丙醇、異丁醇、異戊醇和β-苯乙醇分別降低15.10%、25.70%、19.63%和28.17%。

實驗結果表明ADH2基因缺失的酵母能降低高級醇的生成量，但是降低幅度只有11%左右，原因可能是酵母中存在多種脫氫酶都能催化該脫氫反應[12]，而ADH2基因編碼的脫氫酶不是主要脫氫酶的緣故。ADH2和THI3基因缺失的酵母能顯著降低高級醇的生成量（P＜0.05），原因是THI3基因編碼的脫羧酶參與高級醇合成中α-酮酸的脫羧，THI3的缺失減少了相應醛的生成，而ADH2基因缺失又減少這些醛脫氫形成的高級醇，因而協同降低了高級醇的生成量。

2.4 ADH2和THI3基因敲除對發酵性能的影響

重組雙倍體酵母菌株和原始菌糯米酒發酵后的基本發酵性能測定結果見表3。由表3可知，重組菌XF1-A和XF1-AT的CO2產生量、殘留還原糖、酒精度與原始菌XF1相比都無顯著差異（P＞0.05），說明ADH2和THI3基因缺失不影響酵母的基本發酵性能。

表3 重組菌和原始菌XF1的基本發酵性能的比較Table 3 Comparison of basic fermentation performance of recombinant strains and original strain XF1

3 結論

本實驗成功構建了ADH2單基因缺失、ADH2與THI3雙基因缺失的單倍體酵母菌和雙倍體酵母菌。雙倍體重組菌株XF1-A、XF1-AT與原始菌XF1的生長性能、發酵性能都相似，但是釀造糯米酒中的高級醇生成量分別降低11.16%、21.39%。因此，本實驗構建的重組雙倍體酵母菌XF1-AT可顯著降低糯米酒中高級醇生成量，具有潛在的工業應用價值。