液體活檢在食管鱗狀細(xì)胞癌中的應(yīng)用及展望△

努爾斯曼古麗·買買提明，張莉

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院綜合內(nèi)一科，烏魯木齊 830054

食管癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，是全球第八大常見惡性腫瘤及第六大常見惡性腫瘤死亡原因，每年有超過45.6萬新發(fā)病例及40萬死亡病例，目前患者的5年生存率約為20%。食管癌常見的病理類型包括鱗狀細(xì)胞癌和腺癌，其中鱗狀細(xì)胞癌占食管癌的90%。目前，食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）的具體發(fā)病原因仍未完全闡明，目前的研究顯示其發(fā)生與遺傳、生活和飲食習(xí)慣以及慢性損傷等因素均有關(guān)，是影響人類健康的一大殺手。ESCC起源于食管黏膜上皮，是常見的消化道惡性腫瘤之一，也是一種生長(zhǎng)迅速、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高的侵襲性惡性腫瘤，多在70歲左右時(shí)發(fā)病，且男性多見，男女比例為2.5∶1。ESCC因起病隱匿、缺乏特異性導(dǎo)致其早期診斷困難，當(dāng)患者出現(xiàn)進(jìn)行性吞咽困難、體重下降等癥狀而就診時(shí)常為中晚期，且因食管內(nèi)有豐富的淋巴脈管網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致早期行根治性手術(shù)治療后仍有部分患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。近年來的研究表明，從腫瘤組織脫落進(jìn)入淋巴脈管系統(tǒng)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）可導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，因此導(dǎo)致患者預(yù)后差、病死率高。目前常用的食管癌治療方法包括手術(shù)、局部放療、全身化療、靶向治療、免疫治療等，但這些治療效果仍不理想，患者術(shù)后及放化療后易出現(xiàn)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。同時(shí)，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移后可選擇的治療方案有限，從而導(dǎo)致進(jìn)展性ESCC的治療成為臨床上的一大難題。對(duì)于ESCC患者，如果能夠早期診斷并接受治療可大大提高患者的生存率。因此，尋找一種更敏感、安全且能夠早期反映腫瘤進(jìn)展的方法成為ESCC診斷和治療的關(guān)鍵。相關(guān)研究結(jié)果證實(shí)，檢測(cè)循環(huán)腫瘤標(biāo)志物是解決該難題的一個(gè)有效方案。腫瘤在發(fā)生、發(fā)展過程中需要通過血液獲取營養(yǎng)物質(zhì)，壞死、凋亡后的代謝產(chǎn)物也會(huì)釋放入血從而排出體內(nèi)，因此血液是病灶組織以外的最理想檢測(cè)標(biāo)本，CTC、循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循環(huán)腫瘤RNA（circulating tumor RNA，ctRNA）及腫瘤代謝產(chǎn)物中篩選的分子生物標(biāo)志物已經(jīng)在一些惡性腫瘤的診斷和治療中發(fā)揮了一定的作用。基于血液的液體活檢是一種低創(chuàng)檢查，可通過檢測(cè)血液中的循環(huán)標(biāo)志物獲取與原發(fā)灶疾病相關(guān)的信息，并動(dòng)態(tài)觀察疾病的演變過程。本文圍繞液體活檢技術(shù)在ESCC中的最新研究進(jìn)展作一綜述，同時(shí)探討循環(huán)腫瘤標(biāo)志物在ESCC診斷、治療及預(yù)后判斷中的作用及局限性。

1 液體活檢

液體活檢是通過檢測(cè)人體不同體液（包括血液、尿液、糞便、唾液或腦脊液等）中腫瘤相關(guān)生物標(biāo)志物來獲取疾病相關(guān)信息的方法，最常用的體液為血液，通過檢測(cè)血液中從原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤病灶脫落的腫瘤細(xì)胞、DNA、RNA等，可識(shí)別腫瘤相關(guān)突變的存在并獲得疾病最初治療前后、復(fù)發(fā)和演變的信息。與傳統(tǒng)活檢相比，液體活檢是通過非侵入性的方式檢測(cè)患者血液中的DNA、RNA或蛋白質(zhì)，可在疾病不同階段連續(xù)進(jìn)行，易被患者接受，可以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)疾病變化情況并根據(jù)結(jié)果實(shí)時(shí)調(diào)整治療方案及判斷預(yù)后。

2 循環(huán)腫瘤標(biāo)志物

循環(huán)腫瘤標(biāo)志物包括從原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶脫落入血的單個(gè)腫瘤細(xì)胞凋亡或腫瘤組織壞死釋放入血的DNA或RNA、外泌體、腫瘤相關(guān)血小板（tumor-educated blood platelet，TEP）、循環(huán)腫瘤相關(guān)微粒等，這些不同的生物標(biāo)志物均攜帶與原發(fā)腫瘤相關(guān)的遺傳及變異等信息，在腫瘤的診斷和治療中發(fā)揮重要作用。

2.1 CTC

CTC來源于腫瘤組織，原位腫瘤細(xì)胞通過上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）并侵入血液循環(huán)從而形成CTC。1869年，Thomas在1例轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤患者的血液中發(fā)現(xiàn)了CTC。腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT后，細(xì)胞黏附分子表達(dá)減少，獲得間充質(zhì)細(xì)胞表型，細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和播散，導(dǎo)致腫瘤的早期轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。Lianidou等研究表明，CTC可作為多種實(shí)體瘤的生物標(biāo)志物，與實(shí)體瘤的早期診斷、預(yù)后及治療相關(guān)。目前CTC主要通過基于物理學(xué)特征及免疫學(xué)特征的方法進(jìn)行分離及富集，由于具有富集純度高以及能夠保持細(xì)胞活性等優(yōu)勢(shì)，免疫學(xué)富集方法相較于傳統(tǒng)物理學(xué)富集方法應(yīng)用更為廣泛。Li等采用免疫磁珠分離法（magnetic activated cell sorting，MACS）檢測(cè)ESCC患者血液中的CTC，發(fā)現(xiàn)140例ESCC患者中，62例（44.3%）患者檢測(cè)到CTC，且CTC數(shù)量與ESCC患者的臨床分期有關(guān)（P=0.013），提示CTC陽性是ESCC患者的獨(dú)立預(yù)后生物標(biāo)志物。Han等通過優(yōu)化的CanPatrolCTC分型檢測(cè)系統(tǒng)分析21例ESCC患者的血液樣本，共檢測(cè)到129個(gè)CTC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CTC數(shù)量與患者的TNM分期有關(guān)。Han等采用上皮腫瘤細(xì)胞大小分離法（isolation by size of epithelial tumor cell，ISET）測(cè)定60例ESCC患者治療前的CTC，結(jié)果提示患者的無進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）與CTC數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，多因素分析結(jié)果顯示，CTC值＞2是腫瘤復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。臨床上檢測(cè)、計(jì)數(shù)和分離CTC的潛在應(yīng)用價(jià)值可能包括監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)或判斷預(yù)后，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)治療效果。

CTC是完整、有活性的細(xì)胞，包含腫瘤的全基因組、蛋白質(zhì)組等信息，是研究腫瘤組織信息的豐富來源，通過檢測(cè)CTC有助于早期發(fā)現(xiàn)腫瘤侵襲相關(guān)基因特征。通常情況下，進(jìn)入血液的CTC會(huì)在短期內(nèi)被免疫細(xì)胞殺傷，只有具有高度轉(zhuǎn)移潛能的CTC才可以通過免疫逃逸存活下來。通過分離血液中的這些CTC并應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)（next generation sequencing，NGS）獲取CTC的基因組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)信息，通過生物信息學(xué)分析腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的代謝途徑和信號(hào)通路，可能為腫瘤的治療提供潛在靶點(diǎn)。

雖然CTC在ESCC的診療中具有很大的應(yīng)用前景，但是其在臨床中的可行性仍面臨挑戰(zhàn)，主要是由于CTC的檢出率低、特異性低、個(gè)體差異大、費(fèi)用高，在應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方案收集血液樣本保證質(zhì)量一致的前提下，加工前后及過程中仍有可能導(dǎo)致細(xì)胞損傷，使得CTC的分離成為一大難題。此外，對(duì)單個(gè)CTC進(jìn)行基因組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)研究對(duì)技術(shù)及人員的要求較高，且耗費(fèi)大，在臨床上的應(yīng)用受到一定的限制。因此，需要繼續(xù)探索簡(jiǎn)單、可靠的方法提高CTC的檢出率。

2.2 ctDNA

游離DNA（cell free DNA，cfDNA）是存在于體液中的細(xì)胞外DNA，來源于正常細(xì)胞和凋亡、壞死的腫瘤細(xì)胞，而ctDNA是其中的一部分，既攜帶腫瘤細(xì)胞的基本遺傳信息，又?jǐn)y帶基因突變后的信息，包含點(diǎn)突變、重排、擴(kuò)增甚至基因拷貝數(shù)變異。1948年Mandel和Metais首次報(bào)道了外周血中存在cfDNA，目前cfDNA已成為許多醫(yī)學(xué)學(xué)科的熱門研究領(lǐng)域。研究表明，通過測(cè)量ctDNA等位基因突變片段可以獲得定量信息，用于腫瘤診斷并反映腫瘤負(fù)荷情況。Zhou等對(duì)原發(fā)性乳腺癌患者的腫瘤組織DNA及ctDNA進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤組織DNA與ctDNA的基因突變頻率顯著相關(guān)（P＜0.01），并且在局部晚期（P=0.0085）或轉(zhuǎn)移（P=0.0136）的乳腺癌患者血液中檢測(cè)到的ctDNA最大變異等位基因頻率更高，在大多數(shù)乳腺癌患者中能夠檢測(cè)到與腫瘤組織DNA一致的ctDNA片段，提示能夠采用非侵入性的基因組譜分析原發(fā)腫瘤相關(guān)變異信息。Chae等回顧性分析了136例非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者血液中的ctDNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)較高濃度的ctDNA與較短的PFS和總生存期（overall survival，OS）有關(guān)（P＜0.01）。

Luo等通過對(duì)ESCC組織、癌旁組織和正常組織以及手術(shù)前和手術(shù)后的血漿進(jìn)行測(cè)序，分析了ctDNA在ESCC中的特異性和作用，結(jié)果證明利用ctDNA檢測(cè)ESCC和監(jiān)測(cè)治療效果具有可行性。Azad等通過對(duì)食管癌患者放化療前后及健康對(duì)照組血液的DNA進(jìn)行腫瘤個(gè)性化深度測(cè)序（cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-Seq），發(fā)現(xiàn)放化療后ctDNA的檢出率與腫瘤進(jìn)展（P＜0.01）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P＜0.01）和較短的生存期（P＜0.01）有關(guān)。提示ctDNA可反映食管癌相關(guān)的基因信息，并與其發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，有望成為反映食管癌治療效果及預(yù)后的生物標(biāo)志物。

然而，ctDNA的檢測(cè)面臨著巨大挑戰(zhàn)，很大程度上是因?yàn)閏tDNA通常只占總cfDNA的一小部分（＜1.0%），導(dǎo)致分辨困難、檢測(cè)率較低，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)序方法（如Sanger測(cè)序或焦磷酸測(cè)序）只能在腫瘤負(fù)荷重的患者中檢測(cè)到衍生的突變片段，導(dǎo)致提供的信息不全面；雖然ctDNA可以實(shí)時(shí)反映機(jī)體的全身情況，但因其在血液中的半衰期較短，導(dǎo)致檢測(cè)困難，因此限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。

2.3 ctRNA

ctRNA是來源于腫瘤細(xì)胞的游離RNA（cell free RNA，cfRNA）的一部分。幾乎所有已知類型的RNA都存在于體循環(huán)中，且每一類RNA都有可能成為惡性腫瘤生物標(biāo)志物。ctRNA主要分為信使 RNA（messenger RNA，mRNA）、微小 RNA（microRNA，miRNA）和長(zhǎng)鏈非編碼 RNA（long noncoding RNA，lncRNA）。其中，miRNA是一類長(zhǎng)度為18～22 bp的高度保守、內(nèi)源性非編碼小分子RNA，通過降解或抑制靶mRNA完成基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控，在正常組織和腫瘤組織的動(dòng)態(tài)平衡和細(xì)胞間通訊中具有關(guān)鍵作用。研究證實(shí)，miRNA與腫瘤發(fā)生和抑制有關(guān)，并且可以作為腫瘤診斷、檢測(cè)和預(yù)后的重要生物標(biāo)志物。目前為止，已在人類血液中鑒定出2500多個(gè)不同的miRNA，每個(gè)miRNA可直接或間接調(diào)節(jié)數(shù)百個(gè)靶基因，從而調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的增殖、分化、DNA修復(fù)和凋亡等過程。

隨著基因芯片技術(shù)的日益發(fā)展，循環(huán)miRNA在腫瘤的早期診斷、預(yù)后判斷及治療中顯現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。在ESCC中，miRNA通過調(diào)節(jié)癌基因和抑癌基因的表達(dá)，影響ESCC細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲能力，在ESCC的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。Shen等研究了96例ESCC患者與78例健康者的血清miRNA表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ESCC患者的血清miRNA-16-5p、miRNA-197-5p、miRNA-451a和miRNA-92a-3p表達(dá)水平明顯升高[曲線下面積（area under the curve，AUC）=0.856，95%CI：0.794～0.905，P＜0.01]，具有作為 ESCC 診斷標(biāo)志物的潛力。He等通過檢測(cè)70例ESCC患者和40例健康者血漿中miRNA-20a和let-7a的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ESCC患者血漿中miRNA-20a呈現(xiàn)明顯高表達(dá)，let-7a則呈現(xiàn)明顯低表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤分期有關(guān)（P＜0.05）。此外，miRNA-21在ESCC中通過抑制胱天蛋白酶（caspase）而發(fā)揮作用，且與健康對(duì)照組相比，miRNA-21的表達(dá)水平在ESCC患者血液中持續(xù)上調(diào)，然而并不是所有的miRNA表達(dá)上調(diào)。ESCC中miRNA-21已被證實(shí)是預(yù)測(cè)總體生存率及治療反應(yīng)的特異性腫瘤標(biāo)志物。雖然一些研究得出了同樣的結(jié)論，但單個(gè)miRNA在腫瘤診斷及預(yù)后中的價(jià)值仍需進(jìn)一步證實(shí)。

循環(huán)miRNA主要來源于以下幾條途徑：①蛋白質(zhì)-miRNA復(fù)合體以及脂蛋白復(fù)合體（例如高密度脂蛋白）中的主動(dòng)分泌；②通過膜囊泡的主動(dòng)分泌；③當(dāng)多泡體與細(xì)胞膜融合時(shí)通過外質(zhì)體的主動(dòng)分泌；④來源于細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡的被動(dòng)分泌。miRNA在血液或體液中可長(zhǎng)期穩(wěn)定存在，煮沸、反復(fù)凍融、極端酸堿環(huán)境、長(zhǎng)期冰凍保存等方法均不會(huì)損失循環(huán)miRNA，目前已成功應(yīng)用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）技術(shù)提取miRNA，其穩(wěn)定性和特異性均較高。循環(huán)miRNA已表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)，包括在各種類型體液中的穩(wěn)定性高，可抵抗內(nèi)源性核糖核酸酶消化，可應(yīng)用低成本、易于分析和敏感的檢測(cè)方法，以上優(yōu)勢(shì)使循環(huán)miRNA成為潛在的新興生物標(biāo)志物。

2.4 外泌體

外泌體是被膜包裹的胞外囊泡，一般直徑為40～100 nm，多種細(xì)胞在正常及病理狀態(tài)下均主動(dòng)分泌外泌體，它攜帶了各種細(xì)胞成分如蛋白質(zhì)、核酸（mRNA、DNA、非編碼RNA）和脂類。外泌體可以介導(dǎo)細(xì)胞間通訊，通過釋放包含的生物因子，從而改變受體細(xì)胞的分子活動(dòng)。以往的研究已證明，惡性腫瘤細(xì)胞會(huì)增加外泌體的排放，包裹在外泌體中的miRNA被釋放進(jìn)入體液參與腫瘤的生物學(xué)行為調(diào)控。研究表明，ESCC細(xì)胞釋放的外泌體與腫瘤組織本身具有相似的成分，其釋放的內(nèi)容可能會(huì)影響宿主的免疫反應(yīng)，如抵抗化療藥物、促進(jìn)腫瘤增殖及侵襲等。因此，外泌體的miRNA表達(dá)譜是一個(gè)潛在的生物標(biāo)志物，可以提供腫瘤分級(jí)和預(yù)后相關(guān)信息，從而有助于制訂更好的腫瘤個(gè)體化治療方案。

已有研究表明，黑色素瘤和纖維肉瘤分泌的外泌體釋放的膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1（membrane type 1-matrix metalloproteinase，MT1-MMP）會(huì)導(dǎo)致膠原蛋白降解，促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。也有研究顯示，高侵襲性的Hs578T三陰性乳腺癌細(xì)胞的外泌體能夠顯著增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞SKBR3、MDA-MB-231和HCC1954的侵襲和遷移能力。有關(guān)食管癌外泌體研究的報(bào)道較少，Li等研究發(fā)現(xiàn)，ESCC患者血清外泌體中的miRNA-21被受體細(xì)胞攝取后通過靶向程序性死亡受體4（programmed cell death 4，PDCD4）并激活下游的c-Jun氨基末端激酶（c-Jun NH2-terminal kinase，c-JNK）信號(hào)通路，從而促進(jìn)受體細(xì)胞的侵襲和遷移。Qiu等分析了125例ESCC患者和60例健康者血清外泌體中miRNA-182的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外泌體miRNA-182水平有助于區(qū)分健康者與ESCC患者（AUC=0.837，95%CI：0.776～0.887）；此外，高濃度外泌體miRNA-182組患者的OS和PFS均明顯短于低濃度外泌體miRNA-182組（P＜0.05），因此血清外泌體miRNA-182可能是預(yù)測(cè)ESCC不良預(yù)后的有效標(biāo)志物。目前仍需要更多的研究驗(yàn)證外泌體分析的有效性和可靠性。

3 小結(jié)

綜上所述，液體活檢可以作為一種新型的ES-CC檢測(cè)方法，能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)活檢創(chuàng)傷大且可重復(fù)性差等缺點(diǎn)，且通過分析血液中腫瘤相關(guān)生物標(biāo)志物，可動(dòng)態(tài)、準(zhǔn)確地反映腫瘤進(jìn)展情況。此外，液體活檢提供了一種更安全、更方便的技術(shù)來獲取腫瘤相關(guān)分子信息，可以低創(chuàng)動(dòng)態(tài)地對(duì)疾病進(jìn)行早期診斷，幫助臨床醫(yī)師及時(shí)調(diào)整治療方案并進(jìn)一步研究疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，且有助于靶向藥物的研發(fā)。然而，液體活檢在臨床中的實(shí)際應(yīng)用仍存在爭(zhēng)議，目前仍缺乏ESCC特異性生物標(biāo)志物，以上研究結(jié)果尚不能提供有力的結(jié)論證明腫瘤生物標(biāo)志物檢測(cè)與疾病參數(shù)的相關(guān)性。此外，基于液體活檢的基因檢測(cè)需要依靠一些較前沿的技術(shù)如二代測(cè)序、qRT-PCR等，同時(shí)對(duì)檢測(cè)人員要求高，因而限制了其在臨床中的廣泛應(yīng)用。因此，需要大量的相關(guān)研究驗(yàn)證液體活檢技術(shù)在ESCC患者中的有效性和可靠性，同時(shí)需要不斷地開發(fā)更簡(jiǎn)單、更準(zhǔn)確的方法進(jìn)行生物標(biāo)志物監(jiān)測(cè)及療效評(píng)估等。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突