艾迪注射液對人胃癌HGC-27細胞的抗腫瘤作用機制研究△

陳溪雯，錢亞云

揚州大學醫學院（揚州大學轉化醫學研究院）/國家中醫藥管理局胃癌毒邪論治重點研究室，江蘇 揚州 225001

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，腺癌是其中最常見的病理類型。早期胃癌多無特殊癥狀，易被患者忽視，多數患者確診時已處于晚期，錯過了最佳的手術治療時機，只能選擇放化療。化療藥物對腫瘤細胞無選擇特異性，在殺死腫瘤細胞的同時，也會影響正常細胞的功能，不良反應明顯，增加了患者的身心負擔。

從中藥中尋找抗腫瘤活性成分逐漸受到臨床的重視，也是將傳統醫學與現代科學相結合的重要方式。臨床研究及基礎實驗表明，艾迪注射液在提高機體免疫力、抗腫瘤治療等方面的效果較好。

雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）信號轉導通路在生理和病理條件下對細胞生長等多個方面均發揮至關重要的作用，能夠對多種腫瘤細胞進行修飾，包括增殖、分化、運動性和細胞內運輸等，使腫瘤細胞對抗腫瘤療法產生抗性。MTOR通路的異常激活可調節腫瘤細胞的自噬、凋亡、轉移、上皮-間充質轉化（epithelialmesenchymal transition，EMT）等方面，對艾迪注射液可能的分子機制進行探討有重要意義。

人胃癌HGC-27細胞源自未分化的胃癌組織，與其他分化程度的胃癌細胞相比，人胃癌HGC-27細胞惡性程度較高，未分化胃癌患者的預后差，這與艾迪注射液臨床適用條件相符。本文探討不同濃度的艾迪注射液對HGC-27細胞增殖和遷移能力的影響及其可能相關的信號通路，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器

野生型人胃癌HGC-27細胞購自中國科學院研究所上海細胞庫。艾迪注射液購自貴州益佰制藥股份有限公司，注射用順鉑購自齊魯制藥有限公司。兔抗人單克隆抗體β-actin、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）、MTOR、真核翻譯起始因子4E結合蛋白1（eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1，4EBP1）、磷酸化的4EBP1（phospho-4EBP1，p-4EBP1）均購自美國 Cell Signaling公司，兔抗免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）購自美國ABclonal公司，胎牛血清購自美國Hyclone公司，RPMI-1640培養基購自北京索萊寶公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒購自美國Biosharp公司，噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）購自美國Corning公司，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自生工生物工程（上海）股份有限公司。無菌6孔細胞培養板、無菌96孔細胞培養板均購自美國Costar公司；恒溫培養箱、酶標儀、臺式離心機均購自美國Thermo公司，蛋白電泳槽、全自動多功能酶標儀、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠成像分析儀均購自美國Bio-Rad公司，逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）儀購自瑞士Roch公司，倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，制冰機購自德國Scotsman公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基培養細胞，并置于5% CO、37℃的無菌恒溫培養箱內培養，每天觀察細胞狀態并及時更換培養液，將細胞培養至對數生長期，采用胰酶細胞消化液將細胞消化進行后續實驗。

1.2.2 MTT 法檢測細胞增殖能力 取對數生長期的人胃癌HGC-27細胞，調整細胞濃度為5×10/孔，接種于96孔板，采用RPMI 1640培養基培養12 h后，棄上清。分別加入 0、7.5、15.0、30.0、60.0、120.0 mg/ml艾迪注射液的RPMI 1640培養基100 μl，分別作用24、48、72 h后，每孔加入0.5%的MTT溶液20 μl，37℃繼續培養4 h后，棄上清。每孔加入150.0 μl的DMSO，低速振蕩10 min，采用多功能酶標儀于490 nm處測量各孔吸光度（A）。

1.2.3 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 取對數生長期的人胃癌HGC-27細胞接種于6孔板，待細胞鋪滿后，于每孔中線處劃痕，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗3次，洗去漂浮細胞，倒置顯微鏡下觀察刮痕內無細胞。0、7.5、15.0、30.0、60.0、120.0 mg/ml艾迪注射液培養人胃癌HGC-27細胞48 h后，半數抑制濃度（50% concentration of inhibition，IC）為 20.17 mg/ml。后續實驗將6.0、12.0、24.0 mg/ml艾迪注射液處理的人胃癌HGC-27細胞分別設置為低濃度組、中濃度組、高濃度組，以野生型HGC-27細胞作為空白對照組，2.0 mg/L順鉑處理的人胃癌HGC-27細胞作為陽性對照組，每組設3個復孔。繼續培養24 h后，于倒置相差顯微鏡下拍照記錄各孔劃痕的距離。細胞遷移率（%）=100%-未遷移率，未遷移率（%）=培養24 h空白面積/培養0 h空白面積×100%。

1.2.4 蛋白質印跡法（Western blot）檢測AKT、MTOR、4EBP1、p-4EBP1蛋白的相對表達量 取對數生長期低濃度組（6.0 mg/ml）、中濃度組（12.0 mg/ml）、高濃度組（24.0 mg/ml）人胃癌HGC-27細胞，以及空白對照組和陽性對照組人胃癌HGC-27細胞，調整細胞濃度為5×10/孔，接種于6孔板內，培養48 h后，提取細胞總蛋白，BCA法測定濃度。經過SDSPAGE電泳，轉膜90 min，采用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h，加入一抗（濃度為1∶1000），4 ℃孵育過夜。TBST清洗3遍，加入二抗（濃度為1∶2000），室溫孵育2 h，TBST清洗3遍，電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）法采集并分析圖像，計算AKT、MTOR、4EBP1、p-4EBP1蛋白的相對表達量。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 細胞增殖能力的比較

隨艾迪注射液濃度的升高，培養24、48、72 h，人胃癌HGC-27細胞A值均逐漸降低，差異均有統計學意義（

P

＜0.05）；但60.0 mg/ml與120.0 mg/ml艾迪注射液處理的人胃癌HGC-27細胞培養48、72 h時A值比較，差異均無統計學意義（

P

＞0.05）。（表 1）

表1 不同濃度艾迪注射液處理的人胃癌HGC-27細胞培養不同時間的A值比較（±s）

2.2 細胞遷移能力的比較

培養24 h，低濃度組、中濃度組、高濃度組人胃癌HGC-27細胞未遷移率均高于空白對照組，差異均有統計學意義（

P

＜0.05）。高濃度組人胃癌HGC-27細胞未遷移率均高于低濃度組和中濃度組，差異均有統計學意義（

P

＜0.05），但低濃度組與中濃度組人胃癌HGC-27細胞未遷移率比較，差異無統計學意義（

P

＞0.05）。陽性對照組人胃癌HGC-27細胞未遷移率高于空白對照組，但低于中濃度組和高濃度組細胞，差異均有統計學意義（

P

＜0.05）。（表2）

表2 不同組別人胃癌HGC-27細胞未遷移率比較（%，±s）

2.3 AKT、MTOR、4EBP1、p-4EBP1蛋白相對表達量比較

低濃度組和中濃度組人胃癌HGC-27細胞AKT、4EBP1、p-4EBP1蛋白相對表達量均低于空白對照組，且中濃度組人胃癌HGC-27細胞MTOR蛋白的相對表達量低于空白對照組，差異均有統計學意義（

P

＜0.05）。高濃度組人胃癌HGC-27細胞AKT、MTOR、4EBP1、p-4EBP1蛋白相對表達量均低于低濃度組和中濃度組，中濃度組人胃癌HGC-27細胞AKT蛋白的相對表達量高于低濃度組，差異均有統計學意義（

P

＜0.05），但低濃度組和中濃度組人胃癌HGC-27細胞MTOR、4EBP1、p-4EBP1蛋白相對表達量比較，差異均無統計學意義（

P

＞0.05）。（表3）

表3 不同組別人胃癌HGC-27細胞中AKT、MTOR、4EBP1、p-4EBP1蛋白相對表達量的比較（±s）

3 討論

胃癌的發病率、轉移率和病死率均較高，早期診斷率較低，根治性切除率和患者5年生存率也均較低。中醫藥是惡性腫瘤綜合治療的重要部分，主要目的是穩定瘤體，改善患者的臨床癥狀、延長生存期、提高生活質量。艾迪注射液是常用的純中藥復方制劑，其主要成分中的人參、黃芪、斑蝥、刺五加有廣泛的生物活性。李瑞青采用艾迪注射液聯合化療治療62例老年晚期胃癌，結果顯示，與單純化療相比，中藥聯合化療能夠明顯緩解患者的癌因性疲乏程度，提高生活質量，延長生存期。劉沙河系統評價了艾迪注射液對緩解化療不良反應的作用，結果顯示，艾迪注射液能有效減少化療患者白細胞計數和血小板計數降低的風險，減少外周神經毒性反應，減少消化道不良反應。

本研究結果顯示，不同濃度的艾迪注射液處理人胃癌HGC-27細胞24、48、72 h后，細胞的增殖能力受到明顯抑制，呈現出濃度與時間的依賴性，表明艾迪注射液可明顯抑制HGC-27細胞的生長能力。艾迪注射液的主要成分為斑蝥，對正常細胞有一定毒性，因此，后續實驗中分別設置低濃度組、中濃度組、高濃度組，并研究其作用機制，希望在毒性較低的情況下，發揮最佳的抗腫瘤作用。劃痕實驗結果顯示，與空白對照組細胞相比，艾迪注射液處理的人胃癌HGC-27細胞向空白處遷移的能力受到明顯抑制，表明艾迪注射液可能通過抑制胃癌細胞的遷移發揮抗腫瘤作用。

斑蝥是艾迪注射液的主要抗腫瘤成分，為加強斑蝥的抗腫瘤效果，減少毒性，又添加了益氣、活血的人參、黃芪、刺五加。艾迪注射液作為抗腫瘤藥物的分子機制尚未探明，但已有針對其成分的基礎實驗研究。陳慕媛等研究發現，去甲斑蝥酸鈉處理胰腺癌PANC-1細胞后，p-PI3K和p-AKT蛋白的表達均下調，提示去甲斑蝥酸鈉可能通過調節PI3K/AKT通路，下調B細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）蛋白的表達，上調Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2-associated X protein，BAX）和caspase 3蛋白的表達。陳佳欣等研究發現，人參皂苷Compound K（CK）能夠抑制人肝癌細胞BEL-7404的增殖，誘導細胞自噬，下調AKT/MTOR通路相關蛋白AKT、p-AKT、MTOR、p-MTOR的表達，表明人參皂苷CK可以通過調控AKT/MTOR信號通路誘導人肝癌細胞BEL-7404的自噬。

MTOR信號轉導通路是一條酪氨酸激酶級聯信號通路，是細胞生存通路之一。AKT是磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）下游的主要分子，活化的AKT能夠磷酸化下游的多種蛋白，如核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、MTOR和p21基因等來介導細胞生長、增殖、細胞周期和糖代謝。MTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，由MTORC1和MTORC2兩種多蛋白復合物構成。MTORC1的主要功能是通過激活和磷酸化下游分子4EBP1來調節蛋白質合成和細胞生長。AGC激酶由cAMP依賴的蛋白激酶（cAMP-dependent protein kinase，PKA）、cGMP依賴的蛋白激酶（cGMP-dependent protein kinase，PKG）和磷脂依賴的蛋白激酶C（phospholipid-dependent protein kinase C，PKC）組成。研究表明，MTORC2能夠磷酸化AGC激酶家族中AKT的C端疏水模體，對生長因子信號作出響應。兩種復合物相互調節，從而促進蛋白合成、生長因子信號轉導，促進細胞生長和遷移。

為進一步研究艾迪注射液的抗腫瘤作用機制，本研究觀察了MTOR信號通路在其中的作用，結果顯示，不同濃度艾迪注射液處理后的HGC-27細胞中AKT、MTOR、4EBP1、p-4EBP1蛋白相對表達量明顯降低。表明艾迪注射液可能通過抑制MTOR信號通路活化，發揮抗腫瘤作用。

綜上所述，艾迪注射液可能通過抑制AKT、MTOR、4EBP1、p-4EBP1等MTOR信號通路相關蛋白而發揮抗腫瘤作用。但腫瘤細胞的作用機制較為復雜，艾迪注射液是否還通過其他途徑發揮抗腫瘤作用，尚有待后續研究。