白芍內(nèi)生菌與成分、活性相關(guān)性研究進(jìn)展

張 楠，謝若男，楊滿琴，劉勁松，王國(guó)凱，韓明辰，黃宇飛

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230061；2. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012)

白芍為毛茛科植物芍藥

Paeonia

lactiflora

Pall.的干燥根，其味苦、酸，微寒，歸肝、脾經(jīng)，具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽(yáng)的功效。白芍的主要活性成分包括單萜及其苷類(lèi)、三萜類(lèi)和黃酮類(lèi)等，具有調(diào)節(jié)免疫、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤以及保肝等多種藥理作用，臨床常用于調(diào)節(jié)免疫功能，治療風(fēng)濕免疫性疾病。

植物內(nèi)生菌是一類(lèi)存活于健康植物組織內(nèi)部，卻不引起宿主植物表現(xiàn)出明顯病癥的微生物，包括內(nèi)生真菌、內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生放線菌。內(nèi)生菌與宿主植物長(zhǎng)期互利共生的同時(shí)，自身能產(chǎn)生許多生物活性代謝產(chǎn)物，甚至能產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的活性產(chǎn)物以及新的活性產(chǎn)物；還能誘導(dǎo)和促進(jìn)宿主植物活性成分的合成和積累。因此，植物內(nèi)生菌的研究為天然活性產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)和新藥的研發(fā)帶來(lái)了新方向，具有很好的開(kāi)發(fā)以及應(yīng)用前景。然而，目前，白芍的研究多集中在化學(xué)成分以及藥理作用等方面，關(guān)于其內(nèi)生菌的研究尚處于起步階段，還有待進(jìn)一步探索與開(kāi)發(fā)。現(xiàn)對(duì)白芍中內(nèi)生菌的多樣性、生物活性以及次生代謝產(chǎn)物研究進(jìn)行綜述，闡明白芍內(nèi)生菌與成分、活性之間的相關(guān)性，并提出現(xiàn)階段研究中存在的相關(guān)問(wèn)題以及解決方案，以期為白芍內(nèi)生菌進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與利用提供參考。

1 白芍內(nèi)生菌多樣性及生物活性研究

植物內(nèi)生菌分布廣泛且具有豐富的物種、生態(tài)和遺傳多樣性，表現(xiàn)在從不同組織部位、不同生長(zhǎng)年限或不同生長(zhǎng)環(huán)境植物中分離得到的內(nèi)生菌種類(lèi)、數(shù)量以及優(yōu)勢(shì)種屬等方面均具有差異性。

1.1 內(nèi)生真菌多樣性及生物活性研究 馬宗慧等從亳芍根莖部位分離鑒定出24株內(nèi)生真菌，隸屬于9屬13種，分別為鐮刀菌屬(

Fusarium

)、籃狀菌屬(

Talaromyces

)、指形菌屬(

Dactylonectria

)、粘頭菌屬(

Myxocephala

)、

Llyonectria

、青霉屬(

Penicillium

)、交鏈孢霉屬(

Alternaria

)、重組尾孢霉屬(

Rhexocercosporidium

)和

Lopadostoma

，優(yōu)勢(shì)種群為鐮刀菌屬(

Fusarium

)，占總數(shù)的33%。程孝中等從亳芍根、莖、葉3個(gè)部位共分離純化得到101株內(nèi)生真菌，至少歸屬為8屬16種，其中優(yōu)勢(shì)種屬為曲霉屬(

Aspergillus

)、交鏈孢霉屬(

Alternaria

)和青霉屬(

Penicillium

)。另外，葉片中分離出的內(nèi)生真菌多于從根和莖中分離出的內(nèi)生真菌；莖葉之間內(nèi)生菌的相似性指數(shù)(0.733)最高，其次是根和葉(0.615)，莖和根(0.563)。楊瑞先等從洛陽(yáng)芍藥根部分離得到52株內(nèi)生真菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)和ITS序列分析鑒定其分布于7目、13科、15屬，其中優(yōu)勢(shì)種群分別為小球腔菌屬(

Leptosphaeria

)、土赤殼屬(

Ilyonectria

)和鐮刀菌屬(

Fusarium

) 3種。李園園等分別用改良的GYM培養(yǎng)基、TWYE培養(yǎng)基對(duì)白芍內(nèi)生菌進(jìn)行分離鑒定以及抗菌活性和抗腫瘤活性測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GYM培養(yǎng)基明顯比TWYE培養(yǎng)基分離效果好。活性測(cè)試結(jié)果顯示，部分白芍內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)耐藥大腸桿菌(

Escherichia

coli

)和藤黃微球菌(

Micrococcus

luteus

)具有一定的抑制能力，對(duì)抗腫瘤模型的稻瘟霉孢子萌發(fā)具有一定的抑制作用。1.2 內(nèi)生細(xì)菌多樣性及生物活性研究 研究者從新疆塊根芍藥中分離鑒定出11株內(nèi)生細(xì)菌XJU-PA-1—XJU-PA-11，其中XJU-PA-1、XJU-PA-5、XJU-PA-6、XJU-PA-9和XJUPA-10對(duì)植物致病菌抑制作用較強(qiáng)；菌株XJU-PA-1、XJU-PA-6分別被鑒定為枯草芽孢桿菌(

Bacillus

subtilis

)、粘質(zhì)沙雷氏菌(

Serratia

marcescens

)，其中枯草芽孢桿菌對(duì)玉米小斑病菌(

Bipolaris

maydis

)和蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌(

Alternaria

mali

)的抑制能力較強(qiáng)，粘質(zhì)沙雷氏菌對(duì)多種植物致病菌均顯示出很強(qiáng)的抑制作用。楊瑞先等從洛陽(yáng)芍藥根部分離出48株內(nèi)生細(xì)菌，分布于5屬14種，分別為泛菌屬(

Pantoea

)、腸桿菌屬(

Enterobacter

)、氨醇桿菌屬(

Sphingobacterium

)、芽孢桿菌屬(

Bacillus

)及假單胞桿菌屬(

Pseudomonas

)，其優(yōu)勢(shì)種群主要為芽孢桿菌屬及假單胞桿菌屬細(xì)菌，表明芍藥根部的內(nèi)生細(xì)菌資源種類(lèi)豐富多樣且具有地域差異。1.3 內(nèi)生放線菌多樣性及生物活性研究 放線菌是指能夠產(chǎn)生抗生素以及其他多種活性產(chǎn)物的微生物，廣泛存在于藥用植物中。張秀敏等分別采用S、SCA、FYSCA 3種分離培養(yǎng)基從河北產(chǎn)地的白芍根部共分離得到16株內(nèi)生放線菌，其中從FYSCA培養(yǎng)基中分離到的內(nèi)生放線菌菌株最多，表明該培養(yǎng)基相對(duì)其他兩種更適合白芍內(nèi)生放線菌的分離培養(yǎng)。另外，16株內(nèi)生放線菌中有6株對(duì)農(nóng)作物致病菌和人類(lèi)常見(jiàn)病原菌具有抑制作用，其中菌株S-BS033004被鑒定為鏈霉菌(

Streptomyces

)，其對(duì)棉花黃萎病菌(

Verticillium

dahliae

)、小孢擬盤(pán)多毛孢菌(

Pestalotiopsis

microspora

)和耐青霉素類(lèi)(

Penicillin

)金黃色葡萄球菌(

Staphyloccocus

aureus

)具有顯著的抑菌作用。

白芍內(nèi)生菌多樣性研究不僅豐富了白芍內(nèi)生菌種類(lèi)資源，而且為開(kāi)展白芍內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物的分離鑒定、活性檢測(cè)及其機(jī)制方面的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，更為后續(xù)深入研究白芍內(nèi)生菌資源以及新型活性化合物的發(fā)現(xiàn)提供有力的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

白芍內(nèi)生菌生物活性研究結(jié)果表明，白芍內(nèi)生菌具有抗植物病原菌以及人類(lèi)病原菌的能力，還具有潛在的抗腫瘤作用。內(nèi)生菌的抗植物病原菌作用可以有效協(xié)助宿主植物對(duì)抗外來(lái)病原菌，這類(lèi)內(nèi)生菌可以用于生物菌劑的開(kāi)發(fā)，在防治植物病蟲(chóng)害方面具有巨大的應(yīng)用前景；對(duì)人體病原菌顯示出抗菌活性的菌株，為新型抗生素的研究與開(kāi)發(fā)提供了有價(jià)值的資源；菌株的抗腫瘤作用為研發(fā)新型抗腫瘤活性藥物提供了新的方向。內(nèi)生菌生物活性的形成實(shí)則是與內(nèi)生菌中某些次生代謝產(chǎn)物有關(guān)，如粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)生的代謝物靈菌紅素(Prodigiosin, PG)，具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗瘧疾、抗腫瘤和免疫抑制等多種生物學(xué)活性。白芍內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物生物活性的作用機(jī)制還有待探討，今后可以對(duì)其進(jìn)行更深層次的研究以滿足相關(guān)應(yīng)用的需要。

2 白芍內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物研究

內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物類(lèi)型多、活性廣、易規(guī)模化生產(chǎn)，是發(fā)現(xiàn)新的具有生物活性化合物以及先導(dǎo)化合物的重要來(lái)源。因此，內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物的研究日益成為天然藥物化學(xué)研究者關(guān)注的熱點(diǎn)之一。目前，研究者從兩株亳芍內(nèi)生真菌乙酸乙酯提取物中共分離鑒定出42種單體化合物，其中包括13個(gè)新化合物，結(jié)構(gòu)類(lèi)型包含混源萜類(lèi)、苯并-

a

-吡喃酮衍生物、苯并-

c

-吡喃酮衍生物、酰胺型、苯環(huán)衍生物等。王舉濤等從白芍優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌

Penicillium

mariae

-

crucis

發(fā)酵液的乙酸乙酯部位共分離鑒定出10個(gè)化合物，分別為

penicmariae

-

crucis

A (1)、

penicmariae

-

crucis

B (2)、

penicmariae

-

crucis

C (3)、

penicmariae

-

crucis

D (4)、(

E

)-2-甲基己-3-烯二酸(5)、2-乙酰基-3-羥基-5-甲氧基苯乙酸(6)、2-乙酰基-3-羥基-5-甲氧基苯乙酸甲酯(7)、2-乙酰基-3,5-二羥基苯乙酸甲酯(8)、

β

-谷甾醇(9)、過(guò)氧化麥角甾醇(10)；其中化合物1—4為新化合物，化合物5為新天然產(chǎn)物。王舉濤等還從亳芍優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌菌株

Alternaria

alternate

發(fā)酵液的乙酸乙酯部位共分離鑒定出32個(gè)化合物，分別為tricycloalternarenes (TCAs) 15b(1)、TCAs 16b(2)、TCAs 17b(3)、TCAs 18b(4)、alternate A(5)、alternate B(6)、alternate C(7)、alternate D(8)、alteamide(9)、TCAs 5(10)、TCAs 6(11)、TCAs 7(12)、TCAs 8(13)、djalonensone(14)、3-hydroxyalternariol 5-

O

-methylether(15)、altenuisol(16)、1-deoxyrubralactone(17)、methyl 4-acetamido-3-hydroxybenzoate(18)、(

E

)-methyl-5-hydroxy-3-methylpent-2-eno(19)、異苯并呋喃酮A(20)、對(duì)羥基苯乙酮(21)、6-hydroxy-isosclerone(22)、talaroflavone(23)、7-hydroxy-2-hydroxymethyl-5-methyl-4

H

-chromen-4-one(24)、altenarienonic acid(25)、7-hydroxy-2,5-dimethy-4

H

-1-benzopyran-4-one(26)、5-hydroxy-epialtenuene(27)、交鏈孢醇(28)、methyl 3-hydroxybenzoate(29)、stemphyperylenol(30)、細(xì)格菌素(31)、交鏈孢烯(32)；其中化合物1—9為新化合物，化合物7對(duì)MDA-MB-231、MCF-7兩種腫瘤細(xì)胞株的半數(shù)抑制濃度分別為20.1、 32.2 μmol/L，具有一定的抗腫瘤活性。

目前，白芍內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物研究主要圍繞內(nèi)生真菌展開(kāi)，對(duì)于內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生放線菌研究的相對(duì)較少。今后可加強(qiáng)內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物的分離鑒定與活性篩選方面的研究，豐富代謝物種類(lèi)的同時(shí)，有望發(fā)現(xiàn)更多具有生物活性的代謝產(chǎn)物。

3 白芍內(nèi)生菌與成分、活性相關(guān)性研究

植物內(nèi)生菌與成分、活性之間的相關(guān)性主要體現(xiàn)在內(nèi)生菌可以影響活性成分的生成和積累，一是內(nèi)生菌自身能夠產(chǎn)生活性成分，二是內(nèi)生菌能夠促進(jìn)宿主植物產(chǎn)生活性成分。

3.1 內(nèi)生菌自身能產(chǎn)生活性成分 內(nèi)生菌從寄主植物中汲取營(yíng)養(yǎng)并通過(guò)一系列新陳代謝等生命活動(dòng)產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物具有許多生物活性，不僅具有與宿主植物相同或相似的生物活性，而且還具有許多新的生物活性。1993年，Stierle等從短葉紫杉中分離出產(chǎn)紫杉醇的植物內(nèi)生真菌，這說(shuō)明植物內(nèi)生菌具有產(chǎn)生與宿主植物相同或相似活性化合物的能力，因此從植物內(nèi)生菌中尋找生物活性化合物成為一大研究熱點(diǎn)。程孝中等從亳芍內(nèi)生真菌中篩選出4株產(chǎn)芍藥苷的內(nèi)生真菌，分別為細(xì)極鏈格孢菌(

Alternaria

tenuissima

)、黃曲霉菌(

Aspergillus

flavus

)、普通青霉菌(

Penicillium

commune

)和棒束孢屬(

Isaria

)細(xì)腳棒束孢種(

Isaria

tenuipes

)。其中菌株黃曲霉菌(

Aspergillus

flavus

)產(chǎn)芍藥苷的產(chǎn)量達(dá)到342.4 μg/L，可作為規(guī)模化生產(chǎn)芍藥苷的候選菌株。

3.2 內(nèi)生菌能促進(jìn)宿主植物產(chǎn)生活性成分 研究表明，植物內(nèi)生菌不僅自身能合成宿主植物活性成分，而且還能誘導(dǎo)和促進(jìn)宿主植物活性成分的合成與積累，說(shuō)明植物內(nèi)生菌有望成為促進(jìn)藥用植物產(chǎn)生活性成分的刺激源。但是，目前尚無(wú)關(guān)于白芍內(nèi)生菌促進(jìn)宿主植物產(chǎn)生活性成分的相關(guān)研究，后續(xù)可以圍繞該方向進(jìn)行相應(yīng)的研究與探討。

4 白芍內(nèi)生菌相關(guān)研究中存在的問(wèn)題及展望

白芍中內(nèi)生菌種類(lèi)與資源豐富多樣。目前，白芍內(nèi)生菌的研究主要集中在內(nèi)生菌分離鑒定、生物活性以及次生代謝產(chǎn)物方面。內(nèi)生菌菌株的生物活性主要是其具有抑制植物或人類(lèi)病原菌的作用。內(nèi)生菌菌株的抑菌作用為增強(qiáng)植物的抗病性、抵抗不良環(huán)境能力以及篩選新的活性成分提供有力依據(jù)。另外，從內(nèi)生菌中篩選出與宿主植物相同的活性成分，為規(guī)模化生產(chǎn)創(chuàng)造了良好的條件，能有效地縮短生產(chǎn)時(shí)間以及節(jié)約成本，還可拓寬天然藥物發(fā)現(xiàn)的途徑，具有廣闊的開(kāi)發(fā)以及應(yīng)用前景。

然而，白芍內(nèi)生菌研究與應(yīng)用方面仍然有許多需要解決的問(wèn)題。首先，目前白芍內(nèi)生菌的研究重點(diǎn)在于內(nèi)生菌的抗菌作用，而其他活性研究相對(duì)較少，同時(shí)對(duì)抗菌活性較好的菌株未進(jìn)行深入地挖掘。因此，未來(lái)研究方向可著眼于內(nèi)生菌其他生物活性的篩選，豐富白芍內(nèi)生菌的生物功能，還可以對(duì)具有抗菌活性及其他生物學(xué)活性的內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物進(jìn)行深入研究，對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離鑒定與活性篩選，為新藥研發(fā)以及先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)等奠定良好的基礎(chǔ)。其次，對(duì)于產(chǎn)生白芍活性成分的內(nèi)生菌菌株，可以進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化，加強(qiáng)機(jī)制和育種方面的研究，以達(dá)到培養(yǎng)高產(chǎn)菌株的目的。最后，由于產(chǎn)地、采收期以及宿主植物生長(zhǎng)年限等的差異使得白芍內(nèi)生菌種類(lèi)與資源更加豐富多樣，因此在后續(xù)的研究中可以分別對(duì)不同地域、不同采收期或者不同生長(zhǎng)年限的白芍內(nèi)生菌進(jìn)行多樣性對(duì)比研究，在豐富白芍內(nèi)生菌種類(lèi)與資源的同時(shí)，進(jìn)一步闡明內(nèi)生菌在道地藥材次生代謝產(chǎn)物研究中的作用，并揭示內(nèi)生菌影響中藥材品質(zhì)的機(jī)制。