環狀RNA作為生物標志物在急性髓細胞性白血病中的研究進展△

李明德，陳銘，姜輝，周秋梅，卜素，霍星星#

1安徽中醫藥大學第一附屬醫院臨床研究實驗中心，合肥 230031

2安徽醫科大學第二臨床醫學院麻醉學，合肥230031

急性髓細胞性白血病（acute myelogenous leukemia，AML）是一種表現為未成熟的髓系細胞異常增生的血液系統惡性腫瘤。2019年美國白血病新發61 780例，病死22 840例，其中AML占較大比例。AML的發病機制目前尚不完全清楚，多項關于血液系統惡性腫瘤的研究表明環狀RNA（circular RNA，circRNA）可能通過吸附微小RNA（microRNA，miRNA）調控腫瘤細胞的發生發展與耐藥。因此，闡明AML致病及耐藥相關基因的分子機制，尋找潛在有效的AML生物標志物，對于改善AML預后尤為重要。circRNA是一類閉合環狀非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA），沒有5'-帽和3'-多聚腺苷酸尾，初次發現于類病毒，長期以來被認為是RNA異常剪接的副產物，無特定的生物學功能?，F已發現在真核生物中，circRNA可參與機體生長、衰老等多項生物進程。此外，circRNA的異常表達已在AML和多種腫瘤組織中被證實。本文總結了circRNA在AML中的功能作用和研究進展。

1 circRNA概述

1.1 circRNA來源與結構特點

circRNA由RNA聚合酶Ⅱ合成，受剪接因子、順式作用元件、反式作用因子和表觀遺傳變化等多種因素的調控。目前，關于circRNA的生物起源已有多種假說：①前體mRNA（precursor messenger RNA，pre-mRNA）發生外顯子跳讀，形成套索結構并環化，產生circRNA；②pre-mRNA上通過小核糖體蛋白依次剪接加工后形成環狀結構；③pre-mRNA上相鄰的剪接位點被RNA結合蛋白（RNA binding protein，RBP）調控形成circRNA；④前體tRNA（precursor transfer RNA，pre-tRNA）經過tRNA剪接核酸內切酶復合物切割，其中內含子末端被拼接形成tRNA內含子環狀RNA（tRNA intronic circular RNA，tricRNA）。circRNA主要位于細胞質，也可儲存于外泌體中，其閉合的環狀結構與大多ncRNA不同，可不受核酸外切酶的影響。

1.2 circRNA分類

目前，基于circRNA 形成機制，主要分為三大類：外顯子circRNA（exonic circRNA，EcircRNA）、內含子circRNA（circular intronic RNA，ciRNA）和外顯子-內含子 circRNA（exon-intron circRNA，EIcircRNA）。EcircRNA主要定位于細胞質，其功能的發揮通過與miRNA或RBP的相互作用實現。相比EcircRNA，主要位于細胞核的ciRNA和EIcircRNA與miRNA結合位點較少。

1.3 circRNA生物學功能

circRNA生物學功能多樣，尚不完全清楚，目前主要有四種功能：①作為miRNA海綿；②作為轉錄調控因子；③作為蛋白質適配器，通過與蛋白質結合，circRNA可被激活并發揮調節作用；④作為蛋白質翻譯載體，現已發現，包含開放閱讀框的circRNA具有翻譯潛能，例如，circ-ZNF609含1個開放閱讀框，可以通過剪接依賴和非依賴帽子機制翻譯成蛋白質。

2 circRNA在血液系統中的作用

circRNA在全血、血小板、外泌體等血液系統相關細胞組分中廣泛表達，其與機體的發育、衰老和相關疾病進程密切相關，在血液系統的調控中發揮關鍵作用。全血包含了血細胞和血漿所有成分。研究表明，血液成分或全血中存在大量的circRNA，其可能作為重要靶點影響疾病的進程，也可能作為生物標志物為診斷提供依據。Qian等發現circRNA在人外周血單核細胞中大量表達。Zhao等結合RNA微陣列分析數據，提出hsa_circ_0124644可能作為冠心病診斷生物標志物的觀點。因此，全血中circRNA的異常表達可預示某些疾病的發生與進展。血小板是一類體積小且形狀不規則的細胞碎片，來源于成熟巨核細胞，在止血、凝血和血管生成中起到重要作用。Alhasan等培養的成熟血小板中circRNA的相對比例顯著高于巨核細胞，幾種不同的circRNA也在血小板中被鑒定。然而，有關血小板中circRNA在血液系統惡性腫瘤中的研究仍較少，需要深入了解血小板中circRNA與miRNA和mRNA的相互作用關系，以為治療提供新的思路。目前，外泌體已成為細胞間信息傳遞的新媒介并受到日益關注。血漿中的外泌體是一類包含核酸和蛋白質的盤狀雙層脂膜囊泡，可來源于多種血液細胞及腫瘤細胞。在血小板源的囊泡（外泌體和微囊）中，包裹著大量的circRNA，后者通過外泌體轉運至受體細胞，調控受體細胞的生物活性。

3 circRNA與AML

circRNA可通過結合miRNA參與AML的轉錄后調控，激活下游信號級聯，調控相關基因的表達。circRNA與AML的各項進程密切相關，可能作為AML診療的新靶點。

3.1 circRNA作為潛在的診斷和預后標志物

hsa_circ_0000370是由FLI-1基因衍生而來的一種新的環狀circRNA，FMS樣酪氨酸激酶-3（FMS-like tyrosine kinase-3，FLT3）來自Ⅲ型酪氨酸激酶受體亞家族，FLT3內部串聯重復序列（FLT3 internal tandem duplication，FLT3-ITD）突變預示AML預后不良和復發風險增加。Zhang等首次報道circ_0000370在FLT3-ITD突變陽性AML中顯著升高，體外研究證實circ_0000370的過表達顯著抑制細胞凋亡，提高腫瘤細胞存活率，表明circ_0000370可促進AML進展。TargetScan和KEGG結果顯示，circ_0000370通過負調節miRNA-1299，調控S100鈣結合蛋白A7A（S100 calcium binding protein A7A，S100A7A）基因的表達，影響AML的發展，S100A7A的上調也顯示不良預后。因此，circ_0000370-miRNA-1299-S100A7A軸與AML密切相關，circ_0000370可能是調控AML的關鍵基因。

hsa_circ_0001947是長度為861 bp的circRNA，來源于AF4/FMR2家庭成員2（AF4/FMR2 family member 2，AFF2）基因的外顯子，其定量逆轉錄聚合酶鏈反應（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）產物中存在預期大小的頭尾剪接結構，具有較強的穩定性。AFF2由22個外顯子組成，具有復雜的可變剪接模式，參與細胞黏附、膠原生物合成和神經元發育等多種生物學過程。Han等發現hsa_circ_0001947在新發和復發難治性AML患者中表達下調，且與AFF2 mRNA、CREB3調節因子（CREB3 regulatory factor，CREBRF）mRNA的表達呈正相關，提示hsa_circ_0001947可能與AML的發生發展有關。hsa_circ_0001947可通過吸附hsa-miRNA-329-5p調節hsamiRNA-329-5p靶基因CREBRF的表達，影響AML的進展。研究表明hsa-miRNA-329-5p與Toll樣受體途徑和凋亡相關途徑相關。因此，hsa_circ_0001947可作為AML的預后生物標志物，在AML進展中起重要作用，為AML的治療提供新的見解。

hsa_circ_0121582是序列長度為769 bp的circRNA，由線性糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）外顯子1到外顯子7反向剪接形成。Chen等發現AML細胞質和細胞核中顯著低表達的circ_0121582將導致不良預后。WNT/β-catenin途徑相關蛋白異常表達是多數AML發生和發展的必要條件。circ_0121582可調節miRNA-224使GSK-3β表達增加，負調控該通路相關蛋白表達，抑制AML細胞增殖。β-catenin作為WNT信號轉導中樞介質，在AML細胞中表達增加，發生去磷酸化和核轉位。因此，circ_0121582可能通過miRNA-224作用于GSK-3β，抑制WNT/β-catenin信號通路，抑制AML的發展。增加circ_0121582的表達可能是治療AML的重要方法。

circ-ANXA2是一種新的環狀RNA，Ding等研究發現，circ-ANXA2在AML細胞系中表達上調，敲除circ-ANXA2表達，可能是通過增加THP-1和KG-1細胞中miRNA-23a-5p和miRNA-503-3p的表達，誘導THP-1和KG-1細胞凋亡，抑制細胞增殖。因此，circ-ANXA2可作為關鍵靶點，為AML的臨床治療提供新思路。

叉頭框蛋白 O3（fork head box O3，FOXO3）基因是來自叉頭框基因家族的腫瘤抑制基因，可參與調節人體的新陳代謝和細胞周期等進程。circ-FOXO3由FOXO3基因編碼，通過p53和p53上調凋亡調控因子（p53 up-regulated modulator of apoptosis，PUMA）信號通路促進細胞凋亡。Zhou等發現接受初次治療的AML患者中circ-FOXO3和FOXO3的表達量顯著低于健康人群，提示circ-FOXO3可能作為AML的預后指標。此外，Spearman相關性分析發現circ-FOXO3和FOXO3呈正相關。上述信息提示circ-FOXO3與AML的預后密切相關，可能作為AML的治療靶點。

circ_0009910是來源于線粒體融合蛋白-2的外顯子circRNA，定位于1號染色體的12049221～12052747區段。Ping等發現，與正常對照相比，circ_0009910的表達量明顯升高，其高表達與AML患者的風險增加和預后不良密切相關。降低circ_0009910表達可通過miRNA-20a-5p影響AML細胞增殖。

環狀RNA MYB原癌基因樣2（circular RNA MYB proto-oncogene like 2，circMYBL2）來自細胞周期檢查點基因MYBL2的pre-RNA的反向剪切，長度為554 nt，涉及參考基因組hg38的外顯子8～9區域。Sun等發現circMYBL2在FLT3-ITD突變陽性的AML中表達量升高，circMYBL2的低表達特異性抑制FLT3-ITD突變陽性AML細胞的增殖并促進其分化，使FLT3激酶表達水平顯著降低，觸發FLT3-ITD信號轉導。此外，多聚嘧啶區結合蛋白 1（polypyrimidine tract binding protein 1，PTBP1）的低表達抑制circMYBL2誘導的FLT3蛋白表達水平的增加，表明circMYBL2對FLT3的調節依賴PTBP1。因此，circMYBL2-PTBP1軸可能通過促進FLT3/FLT3-ITD蛋白質翻譯調節FLT3-ITD AML的進展。circMYBL2可能在FLT3-ITD突變型AML中發揮重要作用。

3.2 circRNA作為影響耐藥性的重要靶點

circPAN3起源于PAN3基因的13q12染色體上，其蛋白產物是PAN2/PAN3復合體的調節亞單位，與AML的復雜核型密切相關，已引起廣泛關注。Shang等發現circPAN3在AML耐藥細胞株中表達增加，其機制可能是通過促分裂原活化的蛋白激 酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/MTOR途徑實現。沉默AML細胞中circPAN3基因后，其化療敏感性顯著提高，GO和KEGG分析表明circPAN3與miRNA-183和X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）呈負相關。miRNA-183促進白血病細胞由G期向S期轉化，防止細胞凋亡。XIAP是一類拮抗細胞凋亡的蛋白，可通過轉錄后調控作用受到circPAN3的影響。因此，在化療耐藥的AML患者中，circ-PAN3-miRNA-183-miRNA-153-XIAP軸與AML細胞的增殖有關，circPAN3可能是耐藥AML的有效治療靶點。

hsa-circ-0000978和hsa-circ-0000483是兩個新發現的circRNA。Li等構建了耐多柔比星的HL-60細胞株，通過高通量測序和生物信息學分析，篩選出1824個差異表達的circRNA，并構建了AML耐藥相關的ceRNA網絡，最終篩選出hsa-circ-0000978和hsa-circ-0000483作為AML耐藥相關的circRNA，可作為AML耐藥的潛在靶點，但具體作用機制仍有待探討。

4 小結與展望

目前，circRNA的研究已成為熱點，多項研究表明，circRNA可作為miRNA的作用靶點、轉錄調節因子、蛋白質接頭和蛋白質翻譯因子，通過吸附miRNA發揮各種調控作用。但與其他線性RNA相比，circRNA的研究仍只是冰山一角，很多問題亟待解決：①缺乏統一的數據庫和具體的命名標準；②缺乏對circRNA功能的良好注解；③缺乏規范可行的circRNA檢測技術；④缺乏對circRNA相關調控機制的明確理解；⑤circRNA作為AML生物標志物的可行性仍需實驗驗證等。隨著越來越多的circRNA被發現與鑒定，其在AML中的功能和作用機制也將逐漸清晰。