新生兒壞死性小腸結腸炎與腸道微生物群落關系的研究進展

王英豪，戴立英

壞死性小腸結腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是NICU常見的消化道急癥，死亡率高達30%。存活的NEC 病兒往往會出現后遺癥，包括慢性喂養不耐受、短腸綜合征和生長發育遲緩等，其病理特點是腸道黏膜損傷甚至全層壞死或穿孔，1978年，Martin等首次提出了NEC的3個階段和分期標準，Ⅰ期為“可疑”期，X線片以胃潴留和輕度腹脹為特征。Ⅱ期為“腸梗阻”期，主要表現腸梗阻、水腫、腸壁積氣征等。Ⅲ期為疾病的晚期，進展迅速惡化，易發生腸壞死，膿毒性休克，消化道出血，穿孔等嚴重并發癥，此階段常需要手術干預。近年來NEC 受到了廣泛的關注，但其具體發病機制仍未完全明確。剖宮產嬰兒、胎齡較小的嬰兒、出生后使用抗生素和人工喂養的新生兒NEC 發生率較高。有研究發現NEC 前期腸道微生物群落已經出現異常，提示微生物學可能是防治NEC 的一個很有前途的治療靶點。本研究就NEC 與腸道微生物群落關系的研究文獻進行綜述，為NEC 的預防及治療提供參考依據。

1 新生兒腸道微生物群落變化的影響因素

近年來，隨著高通量測序技術的發展，各種關于微生物組學的檢測手段陸續出現大大擴展了我們對微生物群落的認識。腸道微生物群落擁有數千種細菌，它們在維持體內微生態平衡方面起著至關重要的作用。腸道菌群定植是一個程序化的過程，出生后嬰兒的腸道最初被兼性厭氧菌定植，以桿菌為主，隨著時間的推移出現專性厭氧菌，如擬桿菌、雙歧桿菌和厚壁菌門。影響微生物早期定植的因素是多方面的，包括胎齡、分娩方式、喂養方式、環境因素、使用抗生素、抑酸藥物等因素，潛在甚至可能是宮內傳播。出生后新生兒腸道微生物定植經歷兩波發育，第一波菌群發育對于足月兒和早產兒來說沒有區別，主要取決于分娩方式，陰道出生的嬰兒最容易被母親的陰道微生物感染，幾項研究報道經陰道分娩的嬰兒擬桿菌豐富度較高，以乳酸桿菌、普氏菌和雙歧桿菌為主；而剖宮產兒微生物群落差異較大，以葡萄球菌為主，而雙歧桿菌和擬桿菌定植延遲，腸桿菌科定植率增加。第二波菌群發育因素在足月和早產兒之間有所不同，在足月兒中主要受喂養方式如母乳或配方奶喂養的影響，母乳喂養促進了更接近母親的微生物群發展，其貢獻來自母乳的含量和與乳暈皮膚的接觸，母乳中含有人乳低聚糖（HMO），可刺激雙歧桿菌和擬桿菌生長，幫助選擇有益的微生物，為其提供生長的基質，降低機會性致病菌對新生兒腸道的侵襲，故母乳喂養嬰兒的微生物群富含雙歧桿菌和擬桿菌；相比之下，配方奶喂養的嬰兒仍然以鏈球菌、葡萄球菌和乳酸桿菌為主。而早產兒受喂養方式影響較小，微生物群主要以梭菌和腸桿菌為主要特征，雙歧桿菌和擬桿菌數量較少。因此母乳喂養嬰兒體內存在一種以雙歧桿菌為主的微生物群落，而配方奶喂養的嬰兒體內微生物雖多樣化，但潛在有益菌水平較低。由于新生兒免疫系統不成熟，感染風險較大，臨床醫生經常會給予可疑或確診感染的嬰兒抗生素，抗生素的暴露對新生兒微生物群有很大的影響，延緩了有益細菌的定植，減少腸道微生物群的多樣性，抗生素治療可能導致新生兒（胎齡≤32 周和足月兒）第一個月腸道內細菌多樣性降低，腸桿菌豐富度增加15% 左右，雙歧桿菌數量明顯減少。Patricio-S 等表明，在第一周接受5～7 d 經驗性抗生素的嬰兒，在出生后第2 周和第3 周，變形桿菌相對豐度增加至54% 左右（正常＜1%），細菌多樣性降低。Zhou 等發現圍產期抗生素暴露也可導致母親陰道和新生兒腸道微生物菌群失調，且乳酸桿菌豐度顯著下降40% 左右。抑酸療法對早產微生物群也有明顯的影響，通過抑制胃酸分泌加劇胃腸道殖民化，導致胃腸菌群失調。Gupta 等證明在早產兒中應用H2受體阻滯劑限制了糞便微生物群的多樣性，以變形桿菌為主。這些因素綜合起來，對新生兒腸道菌群的定植、微生物多樣性的發展、菌群穩定性的增加、醫院獲得的潛在致病菌和雙歧桿菌的定植等產生深遠而有害的影響。

2 NEC與腸道微生物群落變化關系

盡管對NEC 病理生理學研究進行了幾十年研究，目前仍未發現單一的致病因素，與腸道微生物的研究發現側重于腸道微生物失調，而不是一種特定的病原體。正常菌群在上皮細胞表面的生長繁殖形成了生物屏障，優先占領生存空間，妨礙或抑制外來致病菌的定植。當腸道菌群正常的定植過程遭到破壞或延遲，將導致腸道菌群結構發生改變，使正常菌群與宿主間的生態平衡失調，一些正常菌群成為機會致病菌，觸發炎癥反應，嚴重者甚至引起NEC。

對早產兒糞便微生物組進行測序的首批研究之一表明，微生物多樣性降低，同時屬于變形桿菌門的一個屬的優勢伴雙歧桿菌豐富度減少是導致NEC 發病的關鍵。近年來，多項研究表明，早于NEC 發病前數天至數周，NEC 病兒已經發生腸道菌群失調且革蘭陰性桿菌豐富度增多，即生態失調早于NEC 發病。幾項對變形桿菌門的病例對照研究表明，在出生后3周以上出現NEC的早產兒，往往會在發病前數天至數周出現這種生態失調。Pammi等Meta分析指出變形桿菌的豐度的增加在胎齡＜27 周嬰兒中最為明顯，他們還發現這些NEC 病兒Alpha 多樣性和Shannon 指數降低（Alpha 指一個特定區域或生態系統內的多樣性，是反映豐富度和均勻度的綜合指標；Shannon 指數即種群之間物種多樣性，其值越大表明菌群多樣性越高），同時通過針對16S rRNA 細菌基因的高變區V3-V5的研究發現，與針對V1-V3 區域研究相比，變形桿菌的相對豐富度更高，厚壁菌門的豐富度更低。Ho 等對45 例出生體質量＜1500 g 早產兒的4 周內糞便進行連續分析發現，糞便γ-變形桿菌的總體比例隨著出生年齡的增加而增加，且變形桿菌定植和NEC 發病率似乎在月經后同一時期[（31±3）周］達到高峰，在出生后≤2 周時變形桿菌相對豐度42.5% 左右，第三周變形桿菌相對豐度69.7%，第四周高達75.5%。為了進一步了解NEC 發生時的腸道菌群變化，Joann 等采用16s rRNA 基因測序及定量聚合酶鏈反應技術，分析了12例NEC 手術腸段和14例非NEC 手術腸段樣本，發現NEC 組中變形桿菌門占主要地位，且葡萄球菌和梭狀芽孢桿菌過表達。Warner 等對122例嬰兒的2492個糞便樣本研究發現，與健康嬰兒相比，樣本中28例NEC病兒γ-變形桿菌比例更高，1個月后最高峰可達80% 左右，梭狀芽孢桿菌和Negativicutes 綱比例更低，僅為10% 左右。為排除外界環境和遺傳因素影響，Suchitra 等對25周雙胞胎（雙胞胎A 無NEC，雙胞胎B 最終發展為NEC）糞便樣本進行16s rRNA 基因測序研究發現，在診斷為NEC 2 周前雙胞胎的微生物菌群差異明顯，雙胞胎B 在診斷為NEC 前1 周腸道菌群多樣性大幅下降，且變形桿菌豐富度增加，約70%，而雙胞胎A腸道菌群主要以梭菌和桿菌為主。除了以糞便為基礎的研究外，最近一項對疾病部位的甲醛固定石蠟包埋組織的分析也發現，與自然隔離穿孔對照組相比，NEC 病兒中γ-變形桿菌的相對豐度較高，平均升高50%，厚壁菌門和擬桿菌的相對豐度較低，平均降低了15%，微生物多樣性更低。

由于早產兒不成熟的免疫系統和經常留置生命支持裝置，故早產兒的腸道菌群與足月兒相比主要以腸桿菌科、弧菌科和假單胞菌科的革蘭陰性桿菌居多，故更易感染NEC。此外，早產兒腸道菌群還含有更多的潛在致病菌，如大腸桿菌、葡萄球菌和克雷白桿菌。研究表明，長期接觸抗生素，特別是氨基糖苷類抗生素，可以使早產兒腸道微生物群落的Alpha 多樣性降低，并增加γ-變形桿菌的豐富度。董琳研究發現早期經驗性使用抗生素的早產兒，腸道內雙歧桿菌數量明顯減少，NEC 發生率增高。另一方面，腸道內微生物多樣性高、雙歧桿菌豐度高的早產兒可能不容易發生NEC。

如果微生物失調是導致NEC 發展的原因之一，那么改變早產兒的胃腸微生物群落，將早產兒胃腸微生物群落轉移到更具有保護性的微生物群落，可能會阻止NEC 的發展。總之，建立一個含有多種共生菌的健康胃腸微生物群落對宿主是極其重要的。

3 腸道微生物群落平衡對腸道的保護機制

NEC 的發生幾乎總是在產后1 周后，從不發生在妊娠期，并且NEC 手術病人發現腸壁內存在細菌侵襲，以及無菌動物難以誘導NEC 病變，都凸顯了細菌在NEC 發病中的作用。腸道的健康取決于免疫細胞、宿主細胞和腸道菌群之間的良好平衡，腸道菌群不僅參與機體的代謝和能量儲存，并在建立免疫系統、抵抗病原菌過程中發揮重要作用，種類繁多的腸道微生物群組成機體腸黏膜系統，可以阻止致病菌對上皮細胞的黏附和定植，有助于預防腸道被感致病菌侵襲感染。人類腸道擁有模式識別受體（patternrecognitionreceptor，PRRs），其能夠特異性識別微生物相關分子模式（microbe-associatedmolecularpatterns，MAMPs），并通過支持細胞生長和增殖、細胞保護、調節屏障功能和抗菌肽的分泌來維持小腸穩態，有助于減少病原菌對腸黏膜的黏附、預防腸道感染、調節免疫反應。關于PRRs 如何識別細菌產物，其中研究最多的是Toll 樣受體（TLRs），TLRs 可識別MAMPs，此外，機體對G-菌脂多糖可產生固有免疫反應，其中包括脂多糖配體Toll 樣受體4 的激活（TLR-4），Toll 樣受體4（TLR-4）在NEC 的發生發展中起著重要作用，TLR 4 的表達水平通常在妊娠期間逐漸下降，因此早產兒TLR 4水平較高，早產兒腸道菌群定植不成熟，腸道菌群往往以變形桿菌門為優勢菌，變形桿菌脂多糖成分誘導TLR-4激活后，可通過誘導MAMPs激活特定的TLRs，開啟特異性免疫反應，通過激活轉錄因子NF-κβ 啟動炎癥級聯反應，反過來引起腸上皮細胞凋亡和炎性因子（IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、INF-1）的釋放，更容易引起細胞因子介導的腸系膜血管炎癥，破壞腸道免疫功能，造成腸組織局部缺血壞死，其中促炎細胞因子IL-8，可增加中性粒細胞的趨化性，進一步加重炎癥、組織損傷和NEC。Hui 等發現在孕周在28～29周的NEC病兒腸切除標本中促炎細胞因子增加及TLR 4表達增強。腸道共生菌可通過阻止TLRs 對腸道的識別或通過阻斷NF-κβ 抑制劑的降解而下調NF-κβ 通路，誘導抑菌肽分泌，限制炎癥反應，促進腸黏膜修復。除了TLR 4 通路，其他的途徑和細胞類型被認為在NEC的發展中很重要，包括血小板活化因子和Smad7 抑制蛋白途徑。其中血小板活化因子是一種潛在存在于各種組織中磷脂炎癥介質，其激活可導致胃腸上皮細胞損傷、凋亡、黏膜通透性增加、緊密連接受損以及血管收縮，破壞胃腸道屏障功能；脂多糖通過誘導Smad7 抑制蛋白中斷轉化生長因子（TGF-β）信號表達和增強巨噬細胞NF-κβ 介導的炎癥反應，并且在NEC標本中發現Smad7表達增強。

試驗報告表明，益生菌干預可增強腸道屏障，減輕腸道損傷，抑制腸道菌群失調，顯著降低NEC的發病率。唐佳等通過羅伊氏乳桿菌（L.reuturi）DSM17938 菌株對NEC 小鼠模型研究得出，實驗組通過羅伊氏乳桿菌干預可降低NEC 中炎性因子TNF-α，IL1-β表達，提高腸道GSH含量、SOD抑制率和活力，從而減少腸道氧化應激反應，增強抗氧化能力，減少腸道炎癥反應，降低NEC 發病率。除此之外，腸道內細菌可通過其代謝產物調節宿主腸道免疫力。乙酸、丙酸、丁酸等細菌經結腸內厭氧菌酵解產生短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs），一方面可以為宿主提供能量，通過激活G 蛋白偶聯受體（G protein-coupled receptors，GPCRs）途徑，促進中性粒細胞向炎癥部位趨附，誘導分泌白細胞介素-10（IL-10），從而發揮抑制炎癥的作用。還可以抑制組蛋白脫乙酰基酶（histone deacetylases，HDACs）途徑，減少脂多糖配體TLR-4 的激活，從而抑制中性粒細胞激活，減少TNF-α 釋放，起到抗炎作用，降低NEC風險。

因此腸道共生菌的減少、菌群多樣性的下降可以導致新生兒胃腸屏障功能下降，將降低腸道上皮細胞對潛在致病菌的防御能力，增加NEC 發生風險；反之某些益生菌和細菌產物的干預可以減少腸道炎癥反應，降低NEC的發病率。

4 小結和展望

盡管腸道微生物的作用還沒有被清楚地了解，但是紊亂的腸道微生物群，似乎會使新生兒有更高的發生NEC 的風險，腸道微生物群變化在預防或促進NEC 的過程中具有保護性或致病性作用。新生兒健康的腸道環境可以幫助他們減少腸道炎癥和損傷，盡量避免NEC 發生。腸道微生物組的監測及干預是診斷及預防NEC的一種很有希望的策略。