白及不同極性提取部位對小鼠的止血作用及其機制

楊麗麗， 楊平飛， 韓 雪， 劉 筱， 黃蘇豫，2， 劉佳微，2， 吳明開*

(1.貴州省現代中藥材研究所/貴州省農業生物技術重點實驗室， 貴州 貴陽 550006； 2.貴州大學， 貴州 貴陽 550025)

白及為蘭科植物白及[Bletillastriata(Thunb.) Reichb.F.]的干燥塊莖，是《中國藥典》收載的常用中藥之一，廣泛用于治療吐血、咳血、肺結核吐血、外傷出血、潰瘍病出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂等病癥，療效顯著[1]。白及主要含有聯芐類、聯菲類、二氫菲類、苷類及白及多糖等多種化合物[2]。目前，對白及的研究主要涉及種植加工、成分提取分離與性質研究、抗氧化活性、藥理活性以及藥理作用和臨床應用等[3]，對白及多糖的研究也較多，但缺乏有效的提取分離方法，致使其組分、結構和生物活性研究不深入。雌雄動物在生理學上的特異性常常導致對藥物的反應也存在差異，到目前為止，對白及止血作用的活性部位、對雌雄動物的作用差異及其作用機制缺乏系統的比較。為此，筆者對白及進行提取并研究乙酸乙酯部位、乙醇部位、水提部位對雌雄小鼠的止血作用，在此基礎上探討其發揮止血作用的機制，為白及的進一步開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 動物 SPF級昆明小鼠，體質量20～22 g，均購自長沙天勤生物科技有限公司，許可證號:scxk(湘)2014-0010。小鼠自由攝食、飲水，試驗前適應性飼養7 d。

1.1.2 藥物 白及為安龍縣欣蔓生物科技有限責任公司白及基地采收的干燥塊莖，原植物經貴陽中醫學院何順志教授鑒定為蘭科植物白及[Bletillastriata(Thund.) Reichb.F.]。

1.1.3 試劑 云南白藥，云南白藥集團股份有限公司，批號:ZMA141520141210；羧甲基纖維素鈉，生工生物工程(上海)有限公司，批號:F531BA0017；肝素鈉注射液，江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司，批號:5789001；水合氯醛，國藥集團化學試劑有限公司，批號:20190012；凝血酶-抗凝血酶復合物，批號:20190818，購自貴州綠盟英創生物科技有限公司；纖溶酶原激活物抑制劑-1，批號:20191124，購自貴州綠盟英創生物科技有限公司；乙醇為分析純。

1.1.4 儀器 Centrifuge 5418R臺式離心機，德國eppendorf；DK-98-ⅡA恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；SAF-680T酶標儀，美國寶生物科技有限公司；Hei-VAP Value旋蒸儀，德國海道爾夫Heidolph有限公司；Milli-Q Reference超純水機，美國Millipore有限公司；METTLER AE240十萬分之一電子天平，梅特勒-脫利多儀器上海有限公司；DZF-6050真空干燥箱，上海博訊有限公司醫療設備廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備 準確稱取白及干燥塊莖粉碎1 000 g，75%乙醇回流提取6次，回流2 h/次，提取液減壓濃縮至無醇味，水浴上蒸干，得白及醇提浸膏。取適量醇提浸膏用蒸餾水混懸后乙酸乙酯萃取至色淡。萃取液及萃取后的水層部分減壓濃縮至固體，真空干燥獲得乙酸乙酯提取物、乙醇提取物及水層部分，置于干燥器中避光保存待測[4]。

1.2.2 陽性對照藥干預 SPF級昆明小鼠按云南白藥人臨床用量(2 g/人)的20倍灌胃給藥，即0.667 g/kg。稱取云南白藥粉末6.67 g，加入0.5%羧甲基纖維素鈉100 mL研磨均勻即得給藥劑量。

1.2.3 白及提取物干預 SPF級昆明小鼠按白及人臨床用量(15 g/人)的20倍劑量灌胃給藥，即為5 g/kg。稱取白及醇提浸膏50 g加入0.5%羧甲基纖維素鈉100 mL研磨均勻，灌胃量6.8 g/kg。

1.2.4 全身肝素化小鼠

1)出血時間(BT)測定。取昆明小鼠60只(雌雄各半)，隨機平分為6組，即空白對照組、肝素化模型組、云南白藥組、白及乙醇提取物組、白及乙酸乙酯提取物組、白及水提取物組。空白組和肝素化模型組分別給予0.5%羧甲基纖維素鈉生理鹽水20 mL/kg，其余組小鼠分別灌胃相應藥物和提取物組，給藥1次/d，連續5 d，第5天灌胃給藥60 min后，除空白組外，其余各組均尾靜脈注射肝素鈉3.2 U/只，15 min后用手術刀于距小鼠尾尖0.5 cm處割斷，待血液自行溢出時開始計時，每隔30 s用濾紙吸附血滴1次，直至濾紙吸附無血跡。人工形成創面到出血停止所經時間為小鼠出血時間(BT)。

2)小鼠凝血時間(CT)測定。利用出血時間測定組的昆明小鼠，第5天給藥60 min后，除空白組外，其余各組均尾靜脈注射肝素鈉3.2 U/只，15 min后用內徑1 mm、長10 cm的毛細玻璃管從小鼠內眼球后靜脈叢取血，待血液充滿玻璃管時開始計時，每隔30 s折斷兩端毛細玻璃管(約0.5 cm)，并緩慢向左右拉開，觀察折斷處有無血凝絲出現。血液充滿玻璃管開始至出現血凝絲所經時間為小鼠凝血時間(CT)。

3)血小板聚集率測定。按照測定出血時間的方法，連續灌胃給藥6 d，第7天灌胃給藥60 min后，腹腔注射水合氯醛100 g/L麻醉，用3.8%枸櫞酸鈉抗凝真空采血管腹主動脈釆集血樣，800 r/min離心10 min，分離上層血漿即得富血小板血漿(PRP)，余下部分3 000 r/min離心10 min，分離上層血漿即得貧血小板血漿(PPP)，用PPP調PRP中血小板的計數為3×1011個/L，用PPP調零后，取PRP 290 μL，37℃孵育60 s后，加入終濃度為 5 μmol ADP 10 μL，記錄5 min內血小板的最大聚集率。

4)凝血因子測定。昆明小鼠分組及給藥方法同血小板聚集率測定。取枸櫞酸抗凝全血，3 000 r/min離心10 min，分離上層血漿備用。按試劑盒要求測定凝血酶-抗凝血酶復合物(TAT)、纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)。

1.3 統計分析

試驗數據采用SPSS 19.0統計軟件進行分析，結果用Mean±SEM表示。經單因素方差分析(One-Way ANOVA)后，采用Turkey’s test分析方法比較組間差異，兩組間比較采用t-test法。

2 結果與分析

2.1 白及不同極性提取部位干預雌雄小鼠的出血時間

小鼠尾靜脈注射肝素鈉注射液后，出血時間與空白組相比顯著延長(P<0.005)，說明小鼠出血模型建模成功。與模型組相比，雄性、雌性小鼠云南白藥干預組均能顯著縮短全身肝素化小鼠的出血時間(P<0.005)，白及乙醇提取物、水提取物干預后的雌雄小鼠均顯著表現出與模型組更少的出血時間(P<0.005，P<0.01)；乙酸乙酯提取物干預雌鼠的出血時間與模型組無顯著差異(P>0.05)，干預雄鼠的出血時間顯著高于模型組(P<0.05)(圖1A、圖1C)。將雌雄小鼠的檢測結果組合進行統計分析，云南白藥、白及乙醇提取物、水提取物干預均能明顯縮短全身肝素化小鼠的出血時間(P<0.005)，乙酸乙酯提取物干預的出血時間無顯著變化(P>0.05)(圖1B)；云南白藥、白及乙醇提取物、白及水提取物干預對全身肝素化雌雄小鼠出血時間的縮短率分別為74.36%、48.96%和31.24%(圖1D)。

注：Con為對照組，Mod為模型組，YNBY為云南白藥干預組，H2O為白及水提取部位干預組，EtOAc為白及乙酸乙酯提取部位干預組，EtOH為白及乙醇提取部位干預組。***表示與對照組比P<0.005；#表示與模型組比P<0.05，##表示P<0.01，###表示P< 0.005。下同。圖1 不同組雌雄小鼠的出血時間(n=10)

2.2 白及不同極性提取部位干預雌雄小鼠的凝血時間

小鼠尾靜脈注射肝素鈉注射液后，凝血時間與空白組相比顯著延長(P<0.005)，與模型組相比，雄性、雌性小鼠云南白藥、白及乙醇提取物、白及水提取物干預均能顯著縮短凝血時間(P<0.005，P<0.01)，乙酸乙酯提取物干預雌鼠的凝血時間與模型組無顯著差異(P>0.05)，乙酸乙酯提取物干預雄鼠的凝血時間顯著高于模型組(P<0.05)(圖2A、圖2C)。將雌雄小鼠的檢測結果組合并進行統計分析，云南白藥、白及乙醇提取物、水提取物干預均能顯著縮短小鼠的凝血時間(P<0.005)，乙酸乙酯提取物干預的出血時間無顯著影響(P>0.05)(圖2B)；云南白藥、白及乙醇提取物、白及水提取物干預雌雄小鼠凝血時間的縮短率分別為82.16%、76.44%和34.26%(圖2D)。

圖2 不同組雌雄小鼠的凝血時間(n=10)

2.3 白及不同極性提取部位干預雌雄小鼠血小板的凝集率

云南白藥、白及水提取部分、白及乙醇提取部分干預均能顯著提高雄性小鼠的血小板凝集率(P<0.05，P<0.01，P<0.005)，乙酸乙酯提取物的血小板凝集率無顯著變化(P>0.05)(圖3A)。將雌雄小鼠的檢測結果組合并進行統計分析，云南白藥、白及水提取物、乙醇提取物干預分別提高小鼠血小板的凝集率25.22%、16.36%和11.32%(圖3B)。

注：*表示與對照組比P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.005。下同。圖3 不同組雌雄小鼠血小板的凝集率(n=10)

2.4 白及不同極性提取部位干預雌雄小鼠凝血因子的含量

云南白藥、白及水提取物干預均能顯著提高雌雄小鼠血漿中TAT和PAI-1含量(P<0.01，P<0.05)，乙醇提取物對雌雄小鼠血漿中TAT和PAI-1含量無顯著影響(P>0.05)；乙酸乙酯提取物干預減少小鼠血漿中TAT含量，對PAI-1含量無顯著作用(圖4A、圖4C)。將雌雄小鼠的檢測結果組合并進行統計分析，云南白藥、白及水提取物干預分別提高小鼠血漿中TAT含量20.36%和11.32%，PAI-1含量分別提高18.89%和9.12%(圖4B、圖4D)。

圖4 不同組雌雄小鼠血漿中TAT和PAI-1的含量(n=10)

3 結論與討論

白及的組成成分復雜，許多功能成分還沒有被發現、分離和利用。隨著一些新的活性物質被不斷發現和分離，其生物活性、藥理活性及其作用機制需要闡明。董莉等[5]研究表明，白及塊莖水提物或極性溶劑醇提取物對大鼠實質性器官如肝、脾、肌肉血管出血的止血和凝血效果良好。白及水提物中多為大極性分子，其中包括大量的多糖成分[6]。有研究表明，白及膠多糖發揮止血功能可能是激活了大鼠內源性和外源性凝血系統，促進血小板聚集而達到止血作用[7-10]。白及止血作用的主要有效成分是水溶性部分和醇溶性部分，能顯著提高血小板最大凝集率，促進血小板凝集。白及非多糖組分BS-80EE具有促進ADP誘導大鼠體內血小板的聚集作用，縮短全身肝素化小鼠的出血時間和凝血時間，作用效果呈劑量關系[6]。原因可能是白及能使血細胞凝集，血小板活化、形變，聚集，還能縮短凝血酶生成時間而發揮止血作用。

研究結果表明，白及醇提物、水提物對雌雄小鼠均具有止血作用，其中白及水提物止血作用最顯著，乙酸乙酯提取物對雄性小鼠具有延長凝血、出血時間的作用，但對雌性昆明小鼠未造成明顯影響，可能是激素與凝血調節相關酶能夠相互作用，導致藥物在雌雄昆明小鼠中的止血作用效果存在差異；白及水提物能夠顯著促進血小板凝集作用，并明顯增加纖溶酶原激活物抑制劑-1含量。白及3種提取物的止血作用，以白及水提取物的止血效果最優，表明其具有良好的止血功效，可通過促進血小板聚集和凝血而發揮止血作用。