上游刺激因子1對(duì)腦膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及體外血管生成的影響

李宇 劉宇翔 薩麗波

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)的原發(fā)性腫瘤，約占全部顱內(nèi)腫瘤的40%～50%，臨床治療以手術(shù)、放療及化療為主，但效果不佳[1]。既往研究表明，血管生成在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[2]。據(jù)報(bào)道MOV10結(jié)合circ-DICER1通過(guò)miR-103a-3p/miR-382-5p途徑介導(dǎo)ZIC4的表達(dá)改變進(jìn)而調(diào)控膠質(zhì)瘤血管生成[3]。在膠質(zhì)瘤中血管素（Vasorin，VASN）高表達(dá)會(huì)刺激腫瘤惡性進(jìn)展及血管生成[4]。 FUS/circ_002136/miR-138-5p/SOX13反饋環(huán)在膠質(zhì)瘤中調(diào)節(jié)血管生成[5]。因此，抗血管生成被認(rèn)為是治療腦膠質(zhì)瘤的重要方法，需要對(duì)腦膠質(zhì)瘤的血管生成進(jìn)行深入研究。

腦膠質(zhì)瘤的進(jìn)展取決于腫瘤血管的生長(zhǎng)。膠質(zhì)瘤細(xì)胞能夠分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等促血管生成因子來(lái)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。此外，膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞也分泌許多促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的因子，這些因子的相互作用可以促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)[6]。上游刺激因子（Upstream stimulating factors，USF）基因主要包括USF1和USF2[7]，具有高度保守的bHLH-LZ結(jié)構(gòu)域，能夠結(jié)合E-box的一致序列CANNTG來(lái)調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄[8～10]。USF1基因 定位于chr1q22-23，能夠編碼含有310個(gè)氨基酸殘基的蛋白，共有10個(gè)外顯子，總長(zhǎng)4kb。USF1在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中能夠與組織蛋白酶B啟動(dòng)子區(qū)的E-box序列結(jié)合，增加其啟動(dòng)子活性，促進(jìn)其表達(dá)，調(diào)控腫瘤的侵襲和進(jìn)展[11]。

在前期工作中發(fā)現(xiàn)USF1在腦膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞（Glioma microvascular endothelial cell，GEC）中的表達(dá)水平顯著高于其在人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（Human cerebral microvascular endothel cell，EC）中的。而USF1對(duì)GEC的增殖、遷移和體外血管生成等方面的影響目前尚不十分清楚，值得深入研究，我們的研究將可能為腦膠質(zhì)瘤的抗血管生成治療提供一個(gè)新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系hCMEC/D3 和人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87均購(gòu)自上海富衡生物科技有限公司；內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基ECM （ScienCell）、DMEM培養(yǎng)基（HyClone）、胎牛血清（Gibco）、USF1過(guò)表達(dá)和沉默轉(zhuǎn)染質(zhì)粒均購(gòu)自蘇州吉瑪公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine LTX and PLUS Reagents購(gòu)自Life公司； CCK-8 Kit購(gòu)自日本同仁公司；吉姆薩染液、胰蛋白酶均購(gòu)自北京索萊寶公司；基質(zhì)膠購(gòu)自BD公司；兔抗人USF1多克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體、HRP標(biāo)記的抗兔IgG抗體、HRP標(biāo)記的抗鼠IgG抗體均購(gòu)自Proteintech公司； SDS-PAGE配膠試劑盒、一抗稀釋液、ECL超敏發(fā)光液均購(gòu)自上海碧云天公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建立人GEC模型 用直徑100mm的培養(yǎng)皿培養(yǎng)U87細(xì)胞，近融合時(shí)棄去DMEM高糖培養(yǎng)基（10%胎牛血清），用無(wú)血清培養(yǎng)液沖洗兩次，然后加入無(wú)血清ECM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后用50ml離心管收集，4℃ 離心10min，收集上清液，加入5%胎牛血清，配成膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)液，用其培養(yǎng)hCMEC/D3（EC）細(xì)胞72h后，人GEC模型建立成功。

1.2.2 建立USF1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系 sh-USF1質(zhì)粒（序列 為GCAGATTCAGGAAGGTGCAGT）的載體為pGPU6/GFP/Neo， USF1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的載體為pcDNA3.1（+），陰性對(duì)照為相應(yīng)質(zhì)粒的空載體。GEC細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)將其接種于24孔板中，轉(zhuǎn)染試劑為L(zhǎng)ipofectamine LTX and PLUS，將USF1過(guò)表達(dá)和表達(dá)沉默的質(zhì)粒及相應(yīng)的陰性對(duì)照質(zhì)粒分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染，大約4周后經(jīng)G418篩選培養(yǎng)得到USF1過(guò)表達(dá)和表達(dá)沉默的GEC系，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行樣品制備，Western blot檢測(cè)USF1蛋白的表達(dá)，BCA法測(cè)定蛋白樣品濃度，電泳、轉(zhuǎn)印、封閉、抗體孵育、洗膜、ECL發(fā)光，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。在后續(xù)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中將其分為5組：①對(duì)照（Control）組；②USF1（+）NC組；③USF1（+）組；④USF1（-）NC組；⑤USF1（-）組。

1.2.3 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)（CCK-8法） 轉(zhuǎn)染后分組的GEC接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，密度為2 000 個(gè)/孔，每孔加入200μl膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h后換液，每孔加100μl培養(yǎng)液及10μl的CCK-8試劑，培養(yǎng)箱中孵育2h后酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，波長(zhǎng)450nm。細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白OD值）/（對(duì)照組OD值-空白OD值）×100%。獨(dú)立進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，取平均值計(jì)算分析。

1.2.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中Transwell小室的上室分別加入100μl密度為5×105/ml無(wú)血清膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)液培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染后分組的GEC細(xì)胞，下室加入600ml含5%胎牛血清的膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱中孵育24h后取出Transwell小室，上表面的細(xì)胞用棉簽輕輕擦拭去除，固定液由甲醇和冰醋酸按照3∶1比例配制，細(xì)胞固定30min，然后用10%吉姆薩染液染色30min，PBS充分沖洗，每孔至少3次，在高倍鏡視野中隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞遷移的數(shù)目。獨(dú)立進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，取平均值進(jìn)行分析。

1.2.5 體外血管生成實(shí)驗(yàn) 將96孔板進(jìn)行預(yù)冷處理，每孔加入100μl基質(zhì)膠，37℃放置30min使其聚合，每孔分別加入100μl膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染后分組的hCMEC/D3細(xì)胞，密度為4×105/ml，培養(yǎng)箱中孵育24h后隨機(jī)取5個(gè)高倍鏡視野進(jìn)行拍照，計(jì)數(shù)微血管的長(zhǎng)度及分支數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示計(jì)量資料，兩組間數(shù)據(jù)的分析采用t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)的分析采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 USF1過(guò)表達(dá)和表達(dá)沉默對(duì)GEC增殖能力的影響與對(duì)照組比較，USF1（+）NC組和USF1（-）NC組的細(xì)胞增殖能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與USF1（+）NC組比較，USF1（+）組細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)（P<0.05）；與USF1（-）NC組比較，USF1（-）組細(xì)胞增殖能力降低（P<0.05）。見圖1。

圖1 USF1過(guò)表達(dá)和表達(dá)沉默對(duì)GEC增殖能力的影響

2.2 USF1過(guò)表達(dá)和表達(dá)沉默對(duì)GEC遷移能力的影響與對(duì)照組比較，USF1（+）NC組和USF1（-）NC組的細(xì)胞遷移能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與USF1（+）NC組比較，USF1（+）組細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)（P<0.05）；與USF1（-）NC組比較，USF1（-）組細(xì)胞的遷移能力降低（P<0.05）。見圖2。

圖2 USF1過(guò)表達(dá)和表達(dá)沉默對(duì)GEC遷移能力的影響

2.3 USF1過(guò)表達(dá)和表達(dá)沉默對(duì)GEC血管生成能力的影響與對(duì)照組比較，USF1（+）NC組和USF1（-）NC組的細(xì)胞體外血管生成能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與USF1（+）NC組比較，USF1（+）組內(nèi)皮細(xì)胞的體外血管生成能力增強(qiáng)（P<0.05）；與USF1（-）NC組比較，USF1（-）組內(nèi)皮細(xì)胞的體外血管生成能力降低（P<0.05）。見圖3。

圖3 USF1過(guò)表達(dá)和表達(dá)沉默對(duì)GEC血管生成能力的影響

3 討論

上調(diào)GEC中USF1的表達(dá)后，GEC的增殖、遷移和血管生成能力均增強(qiáng)；下調(diào)GEC中USF1的表達(dá)后，GEC的增殖、遷移和血管生成能力均減弱。上述結(jié)果說(shuō)明了USF1過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)GEC的增殖、遷移和血管生成能力，抑制USF1的表達(dá)能夠降低GEC增殖、遷移和血管生成能力。

在各種組織細(xì)胞中，USF基因表達(dá)廣泛，是一種重要的調(diào)節(jié)因子，各種蛋白的轉(zhuǎn)錄過(guò)程都有其參加調(diào)節(jié)[12]。在人血管平滑肌細(xì)胞中，USF1與cGMP依賴蛋白激酶1的啟動(dòng)子區(qū)的E-box序列結(jié)合，增加其啟動(dòng)子活性，調(diào)控其表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化[13]。USF1參與調(diào)控40余種心血管相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[14]。

在腦膠質(zhì)瘤的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抗血管生成治療是治療高級(jí)別膠質(zhì)瘤的有效方法。然而，由于血管生成擬態(tài)（Vasculogenic mimicry，VM）的存在，神經(jīng)膠質(zhì)瘤的抗血管生成治療在改善患者總體中位生存率方面沒(méi)有顯著效果。研究發(fā)現(xiàn)USF1在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)。敲除USF1通過(guò)刺激 SNHG16和linc00667 抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞中VM相關(guān)蛋白的表達(dá)。通過(guò)SNHG16/miR-212-3p和linc00667/miR-429軸抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞血管生成擬態(tài)[15]。還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)HAS2-AS1在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中高表達(dá)，與預(yù)后不良顯著相關(guān)。沉默 HAS2-AS1 表達(dá)能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲。USF1在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，與HAS2-AS1水平呈正相關(guān)。USF1通過(guò)結(jié)合HAS2-AS1啟動(dòng)子區(qū)域激活HAS2-AS1的轉(zhuǎn)錄，從而增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力[16]。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是最具侵襲性和致命性的腫瘤之一。MUC13 是一種膜結(jié)合粘蛋白，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞 （Glioblastoma stem cell，GSC）中的表達(dá)顯著增強(qiáng)。MUC13的過(guò)表達(dá)顯著增強(qiáng)了GSC的侵襲和遷移能力。研究發(fā)現(xiàn)USF1可以結(jié)合 MUC13 的啟動(dòng)子區(qū)域，從而增強(qiáng) MUC13的激活。研究證明USF1 主要通過(guò)激活 MUC13來(lái)增強(qiáng)GSC的增殖和自我更新進(jìn)而促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的進(jìn)展[17]。研究發(fā)現(xiàn)USF1不僅在腦膠質(zhì)瘤中在其他癌癥中對(duì)癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡、侵襲等方面也有調(diào)控作用。據(jù)報(bào)道在膽管癌中ZFAS1的上調(diào)提示膽管癌預(yù)后不佳，ZFAS1通過(guò)miR-296-5p調(diào)控USF1的表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[18]。在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中USF1通過(guò)誘導(dǎo)LINC01048上調(diào)促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，并且通過(guò)結(jié)合TAF15轉(zhuǎn)錄激活YAP1誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡[19]。在肺癌中USF1通過(guò)誘導(dǎo)長(zhǎng)鏈非編碼RNA WDFY3-AS2過(guò)表達(dá)并通過(guò)靶向調(diào)節(jié)miR-491-5p/ZNF-703軸促進(jìn)肺癌的發(fā)展[20]。USF1還能通過(guò)上調(diào)TGF-β信號(hào)通路進(jìn)而促進(jìn)黑色素瘤的發(fā)生[21]。USF1在胃癌的發(fā)生和發(fā)展中也發(fā)揮重要作用，通過(guò)LncRNA LOXL1-AS1/ miR-708-5p/USF1通路來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)[22]。 USF1還能通過(guò)介導(dǎo)的lncRNA GAS6-AS2上調(diào)并通過(guò)miR-934/BCAT1軸促進(jìn)骨肉瘤的進(jìn)展[23]。在宮頸癌中USF1主要通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活p65的表達(dá)促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的惡性發(fā)展[24]。

綜上所述，USF1可能在調(diào)控GEC的生物學(xué)行為方面發(fā)揮重要作用。具體的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究，以為腦膠質(zhì)瘤的綜合治療提供新靶點(diǎn)和新策略。