補(bǔ)腎開竅祛痰方藥對(duì)缺氧缺血性腦損傷大鼠能量代謝及神經(jīng)細(xì)胞的影響

趙永剛 陳 昊 張洪蘭

江蘇省連云港市第一人民醫(yī)院 222000

缺氧缺血誘導(dǎo)的再灌注損傷可導(dǎo)致腦性癱瘓、腦損傷、精神發(fā)育遲緩等神經(jīng)性并發(fā)癥，故缺氧缺血性腦損傷新生兒的神經(jīng)保護(hù)是新生兒腦血管損傷疾病臨床研究的熱點(diǎn)之一。腦組織缺氧缺血所產(chǎn)生的系列異常級(jí)聯(lián)反應(yīng)，如腦組織能量元素失穩(wěn)、神經(jīng)細(xì)胞異常等均在缺氧缺血性腦損傷的神經(jīng)功能缺損中起到重要的作用[1-3]。補(bǔ)腎開竅祛痰方來源于《備急千金要方》，近年來在治療心腦血管疾病及其并發(fā)癥中療效顯著[4]。但補(bǔ)腎開竅祛痰方對(duì)于腦組織能量代謝及神經(jīng)細(xì)胞是否具有保護(hù)功能仍未見報(bào)道，本研究探討補(bǔ)腎開竅祛痰方在缺氧缺血性腦損傷大鼠神經(jīng)保護(hù)中的作用。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 補(bǔ)腎開竅祛痰方顆粒，配方：升麻、全蝎各10g，醋龜甲、制遠(yuǎn)志、紫河車、菟絲子各8g，鹿角膠12g，石菖蒲、熟地黃、益智仁各6g。委托華潤(rùn)三九醫(yī)藥加工成免煎顆粒，分裝藥品5g/袋。

1.2 動(dòng)物分組和造模 SD大鼠(供貨商：中科院生物學(xué)研究所；質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK(京)2017-0034；動(dòng)物倫理審查證號(hào)：SP-DW-SMP-09-015-01)60只，體重在(200±1)g。按隨機(jī)等分為模型組、正常組、假手術(shù)組、補(bǔ)腎方0.5倍組、補(bǔ)腎方1倍組、補(bǔ)腎方2倍組，每組10只。正常組不予任何處理，其余五組均進(jìn)行手術(shù)造模。模型組、補(bǔ)腎方0.5倍組、補(bǔ)腎方1倍組、補(bǔ)腎方2倍組均采用Longa線栓+缺氧箱法進(jìn)行缺氧缺血性腦損傷模型制備，制備方法為：麻醉后固定四肢，頸正中作切口，以尼龍魚線對(duì)頸外動(dòng)脈作栓塞缺氧處理(即采用尼龍魚線作栓塞動(dòng)脈處理，進(jìn)線長(zhǎng)度8～10mm，以無血流向大腦溢出為缺血造模成功)，并置入8%氧濃度密閉缺氧箱30min腦缺氧處理[5]。假手術(shù)組僅做頸外動(dòng)脈游離處理，不做動(dòng)脈結(jié)扎及缺氧箱處理。造模后觀察大鼠生命體征情況，去除死亡大鼠(注：試驗(yàn)中模型組和補(bǔ)腎方1倍組各死亡1只)。

1.3 動(dòng)物飼養(yǎng)、給藥 各組動(dòng)物正常飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度20～25℃，濕度為40%～70%，飼料為顆粒飼料(SCXK黑2018-008)，飲用水為滅菌水。模型組、正常組、假手術(shù)組不給予任何藥物治療，補(bǔ)腎方0.5倍組、補(bǔ)腎方1倍組、補(bǔ)腎方2倍組均于造模適應(yīng)飼養(yǎng)3d(確定大鼠飲食正常)后分別給予臨床等效0.5倍劑量[4.2g/(kg·d)]、1倍劑量[8.2g/(kg·d)]、2倍劑量[16.8g/(kg·d)]的補(bǔ)腎開竅祛痰方顆粒溶于滅菌水灌胃，連續(xù)治療7d。

1.4 動(dòng)物處理及指標(biāo)收集 各組大鼠于飼養(yǎng)第8天處死并剝離腦組織于液氮中保存，并送華大基因檢測(cè)室進(jìn)行腦組織能量代謝指標(biāo)及神經(jīng)細(xì)胞檢測(cè)。腦組織能量代謝指標(biāo)包括一磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷(ATP)，采用高效液相色譜法測(cè)定，腦組織能荷值計(jì)算方法[6]：(ATP+0.5ADP)/(ATP+ADP+AMP)。神經(jīng)細(xì)胞檢測(cè)包括胸腺嘧啶核苷酸陽性細(xì)胞(BrdU陽性細(xì)胞)、嗅覺中樞陽性細(xì)胞(DCX陽性細(xì)胞)，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 給藥7d后腦組織能量代謝指標(biāo)比較 正常組和假手術(shù)組AMP、ADP、ATP及能荷值比較無顯著性差異(P>0.05)。與正常組和假手術(shù)組比較，模型組、補(bǔ)腎方0.5倍組、補(bǔ)腎方2倍組均下降(P<0.05)，但補(bǔ)腎方1倍組無顯著變化(P>0.05)。與模型組比較，補(bǔ)腎方0.5倍組、補(bǔ)腎方1倍組、補(bǔ)腎方2倍組均提升(P<0.05)，且補(bǔ)腎方1倍組顯著高于補(bǔ)腎方0.5倍組、補(bǔ)腎方2倍組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠給藥后腦組織能量代謝指標(biāo)比較

2.2 給藥7d后腦組織神經(jīng)細(xì)胞比較 正常組和假手術(shù)組BrdU陽性細(xì)胞、DCX陽性細(xì)胞比較無顯著性差異(P>0.05)；與正常組和假手術(shù)組比較，模型組、補(bǔ)腎方0.5倍組、補(bǔ)腎方2倍組均下降(P<0.05)，但補(bǔ)腎方1倍組無顯著變化(P>0.05)；與模型組比較，補(bǔ)腎方0.5倍組、補(bǔ)腎方1倍組、補(bǔ)腎方2倍組均提升(P<0.05)；補(bǔ)腎方1倍組顯著高于補(bǔ)腎方0.5倍組、補(bǔ)腎方2倍組(P<0.05)。見表2、圖1～2。

圖1 各組大鼠給藥后腦組織BrdU細(xì)胞檢測(cè)圖

表2 各組大鼠給藥后腦組織神經(jīng)細(xì)胞比較個(gè)/cm3)

3 討論

缺氧缺血性腦損傷在中醫(yī)并未明確病名，可概述為因虛致瘀而損，故中醫(yī)治療可以益氣化瘀、填精補(bǔ)腎、活血開竅為組方法則[7]。補(bǔ)腎開竅祛痰方藥組成以醋龜甲、鹿角膠等10味中草藥組方，其中醋龜甲、鹿角膠具備滋腎養(yǎng)血功效，增以熟地黃、紫河車的補(bǔ)腎填精功效，制遠(yuǎn)志、石菖蒲具有疏風(fēng)祛痰功效，研究表明，遠(yuǎn)志根的提取物含寡糖及含皂苷等物質(zhì)能明顯提高對(duì)腦組織的保護(hù)效果；其次石菖蒲水提取成分能對(duì)腦皮質(zhì)谷氨酸NMDA受體與配體結(jié)合，從而發(fā)揮對(duì)腦組織的保護(hù)作用，減少神經(jīng)細(xì)胞損傷；并且研究表明，菟絲子、益智仁具有健腦開竅功效，菟絲子對(duì)小腦神經(jīng)元也有保護(hù)作用，同時(shí)益智仁中的原兒茶酸能通過降低內(nèi)源性抗氧化酶活性、抑制體內(nèi)自由基的形成從而實(shí)現(xiàn)良好的神經(jīng)保護(hù)作用，同時(shí)升麻、全蝎可引藥入腦、提升療效，全方可共奏益氣化瘀、填精補(bǔ)腎、活血開竅、疏風(fēng)祛痰的藥效[8]。

在補(bǔ)腎開竅祛痰方對(duì)缺氧缺血性腦損傷大鼠腦能量代謝影響方面的國(guó)內(nèi)外研究集中于能量代謝指標(biāo)、神經(jīng)細(xì)胞等方面。在腦組織血流完全阻斷或不足情況下，腦組織能量代謝及能量元素離子的平衡會(huì)打破，磷酸腺苷會(huì)快速大量的增值，如磷酸腺苷類物質(zhì)包括AMP、ADP、ATP等是局部代謝能荷指標(biāo)的高表達(dá)會(huì)引起腦組織水腫、細(xì)胞壞死等[9-11]。神經(jīng)細(xì)胞水平在缺氧缺血性腦損傷中產(chǎn)生重要重要作用，如BrdU細(xì)胞、DCX細(xì)胞等，其均是機(jī)體神經(jīng)反應(yīng)的重要效應(yīng)因子。研究證實(shí)了腦組織能量代謝水平和神經(jīng)細(xì)胞水平與缺氧缺血性腦損傷大鼠之間的關(guān)系[12-13]。本研究顯示，中藥治療三個(gè)組大鼠腦組織能量代謝指標(biāo)、神經(jīng)細(xì)胞均得到改善，可見補(bǔ)腎開竅祛痰方藥可顯著改善缺氧缺血性腦損傷大鼠的腦組織能量代謝水平和神經(jīng)細(xì)胞水平。另外，量效依賴性性補(bǔ)腎方1倍組大鼠的腦組織能量代謝指標(biāo)、神經(jīng)細(xì)胞改善效果最佳，提示補(bǔ)腎開竅祛痰方藥在改善缺氧缺血性腦損傷大鼠的腦組織能量代謝和神經(jīng)細(xì)胞水平中有一定的量效依賴性，補(bǔ)腎開竅祛痰方藥顆粒推薦用藥劑量(即1倍劑量)是最佳應(yīng)用劑量。

圖2 各組大鼠給藥后腦組織DCX細(xì)胞檢測(cè)圖

綜上所述，補(bǔ)腎開竅祛痰方可對(duì)缺氧缺血性腦損傷大鼠的神經(jīng)功能損傷起到治療作用，這可能與補(bǔ)腎開竅祛痰方可顯著提示缺氧缺血性腦損傷大鼠的腦組織能量代謝和神經(jīng)細(xì)胞水平有關(guān)。但補(bǔ)腎開竅祛痰方藥應(yīng)用于缺氧缺血性腦損傷新生兒的臨床治療具有一定的量效依賴性，因此臨床應(yīng)用必須謹(jǐn)慎，仍需大量前瞻性試驗(yàn)研究的進(jìn)一步研究。