牛源無(wú)乳鏈球菌分離及其誘導(dǎo)的乳房炎小鼠模型構(gòu)建

劉旭明，尚天甜，彭淑珍，魯強(qiáng)生，曾巧英*，彭婕*

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2. 蘭州市獸醫(yī)中心，甘肅 蘭州 730030)

由傳染性病原體引起的乳房炎被認(rèn)為是奶牛的一種破壞性疾病，表現(xiàn)為乳汁發(fā)生理化性質(zhì)及細(xì)胞學(xué)特性的改變，以及乳腺組織發(fā)生病理學(xué)變化，最終降低奶牛生產(chǎn)性能，給奶業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)為蘭氏分群B群鏈球菌(group B streptococcus，GBS)，是引起奶牛乳房炎的主要病原之一，也是一種能夠引起人和其他動(dòng)物發(fā)生嚴(yán)重感染的病原菌[3]。近些年，構(gòu)建乳房炎模型成為研究相關(guān)致病機(jī)制的一個(gè)重要方向，若直接使用奶牛作為試驗(yàn)動(dòng)物，其成本較高，管控較復(fù)雜，因此，用小鼠構(gòu)建乳房炎模型愈來(lái)愈成為研究熱點(diǎn)[4]。相對(duì)于奶牛，小鼠具有體積小、易操控、成本低等特點(diǎn)。本研究旨在分離并鑒定致病性無(wú)乳鏈球菌并構(gòu)建小鼠乳房炎模型，為進(jìn)一步研究該菌致乳房炎的相關(guān)致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

昆明系孕鼠購(gòu)買于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。無(wú)乳鏈球菌參考株ATCC 13813、藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC 25923由本實(shí)驗(yàn)室保存。無(wú)菌脫纖維綿羊血、瓊脂粉末購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)購(gòu)自TaKaRa公司，AceQ?qPCR SYBR Green Master mix、2×TaqPlusMasterMix(Dye Plus)購(gòu)自諾唯贊生物科技股份有限公司，胰酪大豆胨粉末(TSB)購(gòu)自BD公司。藥敏試紙及生化反應(yīng)管均購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司，TRIzol?Reagent購(gòu)自Ambion公司，分析純甲醛溶液、分析純無(wú)水乙醇溶液購(gòu)自天津市百世化工有限公司。

1.2 無(wú)乳鏈球菌分離鑒定

1.2.1 奶樣采集

觀察奶牛健康狀況、乳房情況，同時(shí)與廠區(qū)奶工溝通，采集患有乳房炎的奶牛乳汁。分別對(duì)奶牛乳房4個(gè)乳區(qū)進(jìn)行消毒，棄去前3把牛乳，用無(wú)菌試管接取5～10 mL乳汁，并做好標(biāo)記。

1.2.2 細(xì)菌的分離鑒定

取奶樣20 μL涂布于含5%綿羊血TSB瓊脂平板，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，挑取不同形態(tài)菌落劃線于TSB瓊脂平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落經(jīng)革蘭染色后鏡檢。鏡檢純一的菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基，220 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，4 ℃保存。

1.2.3 生化鑒定

對(duì)分離菌株進(jìn)行40%膽汁、七葉苷、MR試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、蕈糖、乳糖、棉子糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、阿拉伯糖、山梨醇等15種生化試驗(yàn)，根據(jù)細(xì)菌微量生化反應(yīng)管說(shuō)明書，將已純化的菌落接種于生化反應(yīng)管，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果并記錄。CAMP試驗(yàn)：在5% TSB血瓊脂平板兩側(cè)以金黃色葡萄球菌作一橫線接種，垂直處用被檢菌接種1條線，兩線不能相交，同時(shí)做一陰性對(duì)照。

觸酶試驗(yàn)：取一干凈載玻片，加1滴3% H2O2于載玻片中央，用接種環(huán)挑一單菌置于3% H2O2，觀察有無(wú)氣泡產(chǎn)生。

1.2.4 細(xì)菌16S rDNA PCR擴(kuò)增鑒定

挑取已純化單菌落于TSB液體培養(yǎng)基，37 ℃ 220 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，取50 μL細(xì)菌液體培養(yǎng)物煮沸后，以此為模板，利用引物對(duì)UNI-16s-seqF：CVACGATVCVTAGCYGRYCTG，UNI-16s-seqR：ACGGYTACCTTGTTACGACT進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件為:94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 20 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終末延伸5 min。取4 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，目的條帶大小為1 237 bp，將PCR產(chǎn)物送至金唯智生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果提交NCBI中BLAST軟件比對(duì)，確定細(xì)菌種屬。

1.2.5 藥敏檢測(cè)

參照 Kirby-Baueer 氏法，將分離純化得到的菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，以金黃色葡萄球菌ATCC 25923為質(zhì)控菌株，取20 μL細(xì)菌液體培養(yǎng)物涂布于TSB瓊脂，靜置5 min，用鑷子取藥敏紙片貼于平板，輕壓使其固定，37 ℃倒置培養(yǎng)16 h，測(cè)量抑菌圈直徑，做好相應(yīng)數(shù)據(jù)記錄。判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌環(huán)直徑≥20 mm為高度敏感，15 mm ≤抑菌環(huán)直徑<20 mm為中度敏感， 抑菌環(huán)直徑<15 mm為耐藥[5]。具體藥敏試紙種類及濃度見(jiàn)表1。

表1 藥敏試紙種類及濃度

1.3 乳房炎模型的構(gòu)建

1.3.1 人工感染

將產(chǎn)后7～10 d小鼠隨機(jī)分為空白組，陰性對(duì)照組， HZ-032感染組和ATCC13813感染組，每組3只。攻毒前1～2 h隔開(kāi)母鼠與仔鼠，使得母鼠乳房充盈，母鼠麻醉后經(jīng)乳腺管于第四對(duì)乳腺分別注射104CFU菌懸液；陰性對(duì)照組注射相同體積的無(wú)菌PBS；空白組不做處理。

1.3.2 病料采集與處理

攻毒48 h后將小鼠經(jīng)安樂(lè)法處死，剝離乳腺組織，一側(cè)固定于10%中性甲醛，送至武漢賽維爾生物科技有限公司進(jìn)行HE染色組織切片制備，另一側(cè)分別保存于無(wú)菌PBS和TRIzol試劑，用于檢測(cè)乳腺組織內(nèi)細(xì)菌載量及炎性因子表達(dá)量。

1.3.3 乳腺組織中載菌量測(cè)定

稱取0.1 g乳腺組織，加入0.9 mL無(wú)菌PBS，組織勻漿后梯度稀釋，每個(gè)梯度各吸取100 μL懸液涂布于TSB瓊脂平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜，菌落計(jì)數(shù)計(jì)算乳腺組織中細(xì)菌載量。

1.3.4 熒光定量PCR檢測(cè)炎性因子

根據(jù)NCBI公布的參考序列，利用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，引物序列見(jiàn)表2。用TRIzol法提取乳腺組織RNA[6]，使用PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)試劑盒對(duì)提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。使用AceQ?qPCR SYBR?Green Master mix(High ROX Premixed)熒光定量PCR試劑盒，采用兩步法進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)乳腺組織中炎性因子IL-1α、IL-10、IL-6及TNF-α的表達(dá)量，結(jié)果用2-ΔΔCt值表示。

表2 熒光定量PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 菌落特征及染色特性

乳樣劃線接種于含5%綿羊血的TSB瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)基表面可見(jiàn)乳白色，圓形光滑菌落，β溶血(圖1)。革蘭染色鏡檢可觀察到以短、長(zhǎng)鏈排列的革蘭陽(yáng)性球菌(圖2)。將分離菌株命名為HZ-032。

圖1 HZ-032在血平板上生長(zhǎng)的菌落特征

圖2 HZ-032染色鏡檢(革蘭染色，1 000×)

2.2 生化試驗(yàn)

挑取純化后的單菌落接種于生化反應(yīng)管，37 ℃，24 h后根據(jù)說(shuō)明書判定菌株生化特性。由表3可以看出，HZ-032菌株40%膽汁、MR、蕈糖、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、馬尿酸鹽、觸酶試驗(yàn)呈陽(yáng)性，七葉苷、VP、棉子糖、阿拉伯糖、山梨醇、硝酸鹽還原試驗(yàn)為陰性；ATCC13813菌株40%膽汁、MR、觸酶試驗(yàn)、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、馬尿酸鹽試驗(yàn)呈陽(yáng)性，七葉苷、VP、蕈糖、棉子糖、蔗糖、阿拉伯糖、山梨醇、硝酸鹽還原試驗(yàn)為陰性。CAMP試驗(yàn)可見(jiàn)HZ-032(圖3)、ATCC 13813(圖4)在與金黃色葡萄球菌交界處出現(xiàn)明顯的矢狀溶血。綜上生化鑒定結(jié)果，HZ-032符合鏈球菌特征性生化反應(yīng)，疑似無(wú)乳鏈球菌。

A，B. 金黃色葡萄球菌；C. HZ-032；D. 陰性對(duì)照

A，B. 金黃色葡萄球菌；C. ATCC 13813；D. 陰性對(duì)照

表3 生化試驗(yàn)

2.3 細(xì)菌16S rDNA PCR檢測(cè)

使用16S rDNA通用引物對(duì)分離菌株基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，有條帶的 PCR產(chǎn)物送至金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示分離菌株為無(wú)乳鏈球菌。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，利用MegAlign軟件繪制分離株HZ-032親源關(guān)系圖。由圖5可見(jiàn)，菌株HZ-032與無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)(GenBank登錄號(hào)：NZ_LR134512)處于同一分支。

?本研究分離菌株

2.4 藥敏檢測(cè)

選取林可霉素、四環(huán)素、慶大霉素、萬(wàn)古霉素等10種抗生素，采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果(表4)顯示，質(zhì)控菌株ATCC25923僅對(duì)慶大霉素及萬(wàn)古霉素表現(xiàn)中度敏感，其余均表現(xiàn)高度敏感；HZ-032僅對(duì)慶大霉素表現(xiàn)出中度敏感，而對(duì)其余9種抗生素均表現(xiàn)高度敏感；參考株ATCC13813對(duì)慶大霉素及萬(wàn)古霉素表現(xiàn)中度敏感，其余均表現(xiàn)高度敏感。

表4 藥敏試驗(yàn) mm

2.5 小鼠感染后臨床癥狀

小鼠經(jīng)乳頭感染，空白組和陰性對(duì)照組小鼠精神活躍，被毛光滑，采食、飲水較頻繁；HZ-032和ATCC13813處理組小鼠表現(xiàn)反應(yīng)遲鈍，被毛凌亂，采食、飲水次數(shù)減少，乳頭周圍未表現(xiàn)出明顯癥狀。

2.6 小鼠乳腺組織細(xì)菌載量測(cè)定

稱取0.1 g乳腺組織勻漿后倍比稀釋，涂布于TSB瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，對(duì)乳腺組織內(nèi)細(xì)菌含量進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算1g乳腺組織載菌量，使用軟件GraphPad Prism8繪制柱狀圖并進(jìn)行顯著性分析。結(jié)果顯示，空白組和陰性對(duì)照組未檢測(cè)到細(xì)菌，而HZ-032和ATCC13813處理組細(xì)菌載量達(dá)1010CFU/g左右(圖6)。

注：****表示P<0.000 1。下同

2.7 病理變化及組織切片觀察

剖檢小鼠過(guò)程中可觀察到空白組、陰性對(duì)照組乳腺組織均呈乳白色，并伴有大量乳汁，未觀察到病理變化；處理組乳腺組織呈暗黃色，出血，乳汁減少(圖7)。組織切片結(jié)果顯示，空白組、陰性對(duì)照組乳腺組織結(jié)構(gòu)完整，腺泡界限清晰，腺泡內(nèi)含有乳汁；處理組乳腺腺泡無(wú)明顯邊界，充滿大量中性粒細(xì)胞，腺泡上皮出現(xiàn)脫落、壞死(圖8)。

1，2．乳汁；3，4．出血

1，2．乳汁；3，5．中性粒細(xì)胞；4．腺泡上皮脫落、壞死

2.8 小鼠乳腺組織炎癥因子表達(dá)量檢測(cè)

TRIzol法提取不同處理組小鼠乳腺組織RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)乳腺組織中IL-1α、IL-6、IL-10、TNF-α等4種炎性因子的表達(dá)量。使用軟件GraphPad Prism8繪制柱狀圖并進(jìn)行顯著性分析。結(jié)果表明，HZ-032和ATCC13813感染組IL-1α、IL-10、TNF-α表達(dá)量較陰性對(duì)照組及空白組均顯著升高，HZ-032感染組IL-6水平明顯高于其他各組(圖9)。

注：*表示P<0.05，***表示P<0.001，ns表示P>0.05

3 討論

奶牛乳房炎的發(fā)展可分為病原體入侵機(jī)體、感染和產(chǎn)生炎性反應(yīng)3個(gè)階段，當(dāng)乳頭接觸到來(lái)自受感染乳腺牛奶中的細(xì)菌時(shí)，這些病原菌會(huì)以傳染性的方式在奶牛中傳播[7]。盡管許多細(xì)菌被認(rèn)為能夠引起乳房炎，但無(wú)乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌被認(rèn)為是最重要的傳染性病原體[8]。本研究從乳房炎發(fā)病牛奶樣中分離獲得1株鏈球菌，經(jīng)16S rDNA測(cè)序鑒定為無(wú)乳鏈球菌。小鼠乳腺結(jié)構(gòu)與奶牛乳腺結(jié)構(gòu)類似，較易控制，成本較低，因此成為研究乳房炎模型的最佳實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[9]。將分離株HZ-032經(jīng)乳腺管注射至哺乳期小鼠乳腺內(nèi)，可引起小鼠乳腺組織呈暗黃色、充血出血和乳汁減少。感染后小鼠乳腺組織切片較正常組可明顯觀察到乳腺上皮細(xì)胞溶解，腺泡內(nèi)有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，以上病理變化與倫艷霞等[10]構(gòu)建無(wú)乳鏈球菌性乳房炎BALB/c小鼠模型的病理變化一致。HZ-032菌株感染48 h內(nèi)可從乳腺組織中分離到大量細(xì)菌，表明該菌可造成局部感染，并在乳腺組織中繁殖。該結(jié)果與Trigo等[11]的研究結(jié)果一致。Bannerman等[12]研究表明，無(wú)乳鏈球菌感染后可在乳腺中誘發(fā)促炎性細(xì)胞因子，并且其組織學(xué)改變類似于在患有無(wú)乳鏈球菌乳房炎的母牛乳腺組織病變。而本研究中無(wú)乳鏈球菌分離株HZ-032誘發(fā)小鼠乳腺炎過(guò)程與之前文獻(xiàn)中描述的牛無(wú)乳鏈球菌乳房炎非常相似。先天免疫反應(yīng)在感染的早期階段占主導(dǎo)地位，并受促炎性細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，促發(fā)中性粒細(xì)胞募集到感染的乳腺。當(dāng)巨噬細(xì)胞識(shí)別細(xì)菌時(shí)，它們會(huì)釋放促炎性細(xì)胞因子，例如IL-1、IL-10和TNF-α等，這對(duì)于有效抵抗原發(fā)感染至關(guān)重要[10,12]。IL-6是一種引起炎癥的主要細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)肝臟合成急性期蛋白，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，HZ-032感染小鼠后能夠顯著引起乳腺組織中IL-1α、IL-10、IL-6和TNF-α升高，表明HZ-032感染能夠引起小鼠乳腺組織中強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)[14]。

4 結(jié)論

本研究從患病奶牛乳樣中分離1株致病性無(wú)乳鏈球菌，并成功構(gòu)建小鼠乳房炎模型，對(duì)于研究無(wú)乳鏈球菌致乳房炎的相關(guān)致病機(jī)制有重要意義，同時(shí)也為進(jìn)一步尋找有效的抗菌藥物奠定基礎(chǔ)。