豬源產腸毒素大腸桿菌疫苗的研究進展

趙浩飛,趙紅,徐永平,李曉宇,陳凱迪,楊雪瑩,王麗麗

(大連理工大學生物工程學院，遼寧 大連 116024)

產腸毒素大腸桿菌(enterotoxigenicEscherichiacoli， ETEC)是一種能夠感染人和動物的重要病原菌。ETEC可導致人類出現嚴重的腹瀉問題，不僅能引起嬰幼兒腹瀉，還會造成旅行者腹瀉[1]。仔豬、犢牛、羔羊等幼齡動物也是ETEC主要的致病對象[2], 給養殖業尤其是養豬業造成巨大的經濟損失。一直以來，人們嘗試了各種策略來控制和預防ETEC造成的腹瀉，包括抗生素治療[3]，用特異性抗體進行治療[4]，對具有ETEC抗性的原種豬進行遺傳育種得到抗ETEC的后代[5]和疫苗接種[6]。使用抗生素治療可以緩解ETEC相關腹瀉和其他臨床癥狀。然而，抗生素濫用帶來了更嚴重的問題，如細菌耐藥性和藥物殘留；對妊娠母豬口服特定抗菌抗體可以在養殖過程中提供一定的保護，但代價昂貴且勞動量巨大。同時，遺傳育種方法不僅很難確定具體的遺傳靶點，也很難將其應用于篩選ETEC抗性或易感豬。疫苗接種是可以有效控制和預防ETEC引起的腹瀉的理想方法。本文就ETEC的致病機理以及相關疫苗的研究進展進行綜述。

1 ETEC主要致病因子

實際養殖過程中，ETEC 主要通過糞口途徑傳播，當仔豬吸食母乳時，母豬皮膚上的ETEC細菌可進入到仔豬腸道。同時，由于新生仔豬腸道黏膜免疫系統未發育健全，所以極易受到各類致病微生物的攻擊。在造成仔豬腹瀉的過程中，主要致病因子是黏附素和腸毒素。ETEC主要致病因子的理化性質如表1[7]。

表1 豬源ETEC主要致病因子理化性質

菌毛是ETEC最主要的黏附素，近年來的研究顯示豬源ETEC菌株常見的菌毛類型為F4、F5、F6、F18、F41，能介導ETEC定植于腸道并進行繁殖，然后產生腸毒素引起腹瀉。腸毒素包括熱穩定性腸毒素 (heat-stable enterotoxin, ST) 和熱不穩定性腸毒素 (heat-labile enterotoxin, LT) 兩類。熱不穩定性腸毒素 LTA是由五聚體B亞單位和A亞單位組成[8]。LT在ETEC對宿主腸上皮細胞的黏附和定植方面有著促進作用，但機制尚未明確，新的研究發現，LTB亞基能與細菌外膜囊泡(OMVs)中的脂多糖(LPS)形成“OMVs-LT-GM1”橋梁，從而促進細菌黏附[9]。ST是分子量很小的單體毒素，根據其結構、功能和免疫原性不同分為STa和STb，對兒童和幼畜有較強的毒性。STa的毒性強，STb常出現在ETEC引起的仔豬腹瀉的分離株中。另外，有研究發現STb在一定程度上會影響大腸桿菌的耐藥性[10]。

ETEC主要依賴黏附素和腸毒素引起仔豬腹瀉，ETEC首先在菌毛黏附素的介導下, 牢固地黏附于小腸表面，并大量繁殖，隨后產生多種腸毒素，分別與腸上皮細胞的不同受體結合并作用于上皮細胞，導致腸道水和電解質失衡，無機鹽離子大量流失，引起仔豬腹瀉[11]。

2 豬ETEC疫苗的研究現狀

2.1 全菌滅活疫苗

全菌滅活疫苗是指培養好的細菌未經過菌毛或腸毒素提取，直接進行全菌滅活制作的疫苗，這是目前實驗中和商品化ETEC疫苗的主要制備方法, 如Elanco生產的商用疫苗由4種ETEC疫苗(F4、F5、F6和F41菌株)的混合物組成，Vencofarma開發的商用疫苗抗原包含滅活的F4、F5、F41和987P菌株[12]，以及國內瑞普生物藥業生產的豬痢安和上海海利生物技術生產的痢無憂等大腸桿菌滅活疫苗。這種疫苗制備方法成本低，簡單易得，而且制備的全菌抗原針對性強，對動物的免疫效果明顯。楊德鴻等[13]通過對蘇北地區21個豬場采樣調查，以其優勢血清O8、O101為前提研制出二價滅活疫苗，并對感染小鼠進行免疫試驗，以PBS為對照，結果顯示，該二價滅活疫苗對小鼠的保護率在83%以上。劉澤文等[14]將ETEC培養后取其K88、K99和F6菌毛上清, 經滅活后與氫氧化鋁佐劑、凍干保護劑混合制備成凍干疫苗,懷孕母豬經過2次免疫后, 使用同源ETEC對其后代仔豬口服攻毒, 結果表示, 該滅活疫苗對后代仔豬的保護率均在80%以上, 而對照組則全部發病。但全菌滅活疫苗也有一些局限性：ETEC血清型較多且毒力因子復雜，易發生突變[15]，使得全菌滅活疫苗應用范圍較窄，受地域和環境影響較大。另外，全菌滅活疫苗能發揮免疫效應的成分較少，不具有高效性。

2.2 基因工程疫苗

基因工程疫苗就是用分子生物學技術分析出病原體的主要抗原基因，將其轉入原核或真核表達系統使其生產出相應的抗原，進而制備成疫苗；或者把毒力因子刪除或突變，將其變為無毒性的基因缺失疫苗。菌毛和腸毒素是ETEC的主要毒力因子，應用基因重組技術，將菌毛或腸毒素基因定向插入到細菌細胞中，并使其充分表達，制成ETEC基因工程疫苗。基因工程疫苗很好的解決了ETEC多血清型且毒力因子復雜的問題；可制成多價疫苗，達到預防多種疾病的效果；免疫原性好，生產成本低，適合大規模生產，國內的中牧實業股份有限公司江西生物藥廠生產的仔豬大腸桿菌腹瀉K88-LTB雙價基因工程疫苗和上海海利生物藥品生產的(K88/K99)雙價基因工程疫苗以及碩騰公司生產的利特佳?大腸桿菌病二聯疫苗均已商品化生產使用，對保護動物免受ETEC感染有著較好的防護效果。

菌毛基因工程疫苗研究較為理想，Duan等[16]應用多表位融合抗原(mutiple-epitope fusion antigen，MEFA)技術構建了FaeG-FedF-FAc-FasA-FIM41a MEFA，使用主要菌毛K88和F18的黏附亞基作為骨架，還整合了菌毛K99、F6和F41的黏附亞基的表位，進行小鼠免疫和體外細菌黏附評估。經過MEFA蛋白皮下免疫的小鼠產生了針對五種菌毛的IgG抗體。此外，由MEFA蛋白誘導的抗菌毛抗體顯著抑制K88+、F18+、K99+、F6+和F41+ETEC菌株對仔豬小腸IPEC-1和IPEC-J2細胞系的黏附。Matías等[17]從參與仔豬感染的主要ETEC菌株(F4和F18血清型)中獲得的外膜囊泡(OMV)被包封在涂有Gantrez?AN-甘露糖胺綴合物的玉米醇溶蛋白納米顆粒中，對小鼠和妊娠母豬進行口服免疫，結果表明相對于游離口服給藥，納米顆粒誘導IL-2、IL-4和 IFN-γ水平升高，而且后代哺乳仔豬在血清中呈現特異性IgG，證明這種新型口服亞單位疫苗具有良好的感染保護能力。

腸毒素基因工程疫苗也有較好的發展，Zhang等[18]將腸毒素STa、STb和LTB基因通過連接肽進行連接，構建重組SLS表達質粒，并導入E.coliBL21菌株中制備重組 SLS 抗原蛋白，同時提取純化 K88、K99、F6、F41 菌毛抗原蛋白，制備成腸毒素-菌毛復合多價疫苗， 在母豬產仔前30和15 d分別免疫接種一次，發現免疫組后代仔豬無腹瀉現象，對照組30%出現腹瀉，說明候選疫苗對ETEC腸毒素或菌毛抗原起到了較好的免疫效果。Song等[19]構建了三價腸毒素蛋白STa-LTB-STb和F5菌毛的抗原融合蛋白(SLS-F5)以乳酸乳球菌為載體，制備了抗ETEC口服疫苗，對小鼠口服免疫后能誘導機體產生高水平黏膜SIgA和血清IgG抗體和多種細胞因子的產生。而且，口服免疫小鼠在ETEC攻擊后產生了完全的保護。

2.3 弱毒疫苗

弱毒疫苗是指用人工致弱或自然篩選的弱毒株，經過培養后制備成病原致病力減弱但仍具有活力的完整病原疫苗。該疫苗可在免疫動物體內繁殖，用量小；免疫原性好，成本低。Coliprotec?F4[20]和二價F4/F18疫苗[21]是為免疫斷奶仔豬腹瀉而設計的弱毒疫苗。Harutyunyan等[22]基于一種減毒的志賀氏菌活菌株，通過異源表達兩種ETEC抗原LTB和無毒的ST突變體STN12S構建了一種志賀氏菌和ETEC氏菌聯合疫苗(ShigETEC)，并在動物模型中誘導高滴度的抗細菌裂解物的免疫球蛋白和免疫球蛋白抗體，以及具有中和能力的抗ETEC毒素抗體。Nadeau等[21]將2株非致病性ETEC F4和F18制備為二價弱毒疫苗, 經一次口服免疫仔豬, 結果顯示, 該二價弱毒疫苗能預防7～21 d由F4和F18 ETEC引起的仔豬腹瀉, 另外免疫組仔豬F4和F18 ETEC菌株的定植明顯減少, 同時能夠在仔豬體內檢測到F4或F18特異性IgM和IgA抗體。弱毒疫苗使用的弱毒株是活的生命體，易通過胃酸環境進入小腸并定植在腸上皮細胞，引發機體黏膜免疫，有著較好的免疫效果，但弱毒株的毒力在傳代過程中有毒力返強的風險，存在一定的安全問題。

2.4 DNA疫苗

DNA疫苗又稱核酸疫苗或基因疫苗，是指將含有編碼蛋白抗原基因的重組真核表達載體直接注射到動物體內，使外源基因在活體內表達，產生的抗原激活機體的免疫系統，從而誘導機體產生免疫應答，產生特異性抗體。DNA疫苗使用一次能產生長期保護效果，疫苗的免疫原性好，一種DNA疫苗就能誘導多個抗原表位的免疫保護作用，具有較好的靈活性，便于生產且成本低。Melkebeek等[23]將編碼ETEC F4ac菌毛faeG基因的重組質粒和編碼不耐熱性腸毒素LT基因的重組質粒分別以500 μg皮內注射和250 μg肌內注射到5周齡的仔豬, 21 d后加強免疫1次, 測定仔豬血清FaeG特異性抗體, 顯示IgG能長時間持續較高水平,而IgA和IgM抗體水平非常低。Lu等[24]通過使用缺乏腸毒性但保留免疫原性的抗原決定簇替代LT類毒素作為呈現兩個ETEC菌毛和四種毒素的中和抗原決定簇的骨架，我們生成了菌毛毒素MEFA并對小鼠進行皮下免疫，免疫的小鼠對K88、F18、LT和STb產生了強烈的IgG反應，對毒素Stx2e和STa產生了中和反應。另外，MEFA誘導的抗體抑制了K88或F18細菌對豬腸道細胞的黏附，并中和了LT、STa、STb和Stx2e毒素的毒性，證明了該疫苗的具有一定的應用潛力。但是DNA疫苗有一定的局限性，編碼抗原的基因可能會整合到宿主基因上，安全性較低，在機體中長期存在還可能引起免疫耐受現象，這也是DNA疫苗研究待解決的問題。

3 展望

ETEC引起的仔豬腹瀉給全球的養豬業造成了巨大的經濟損失，抗生素的廣泛使用帶來了嚴重的安全問題，因此接種疫苗成為預防仔豬腹瀉的重要手段。盡管對ETEC疫苗的研究取得了很大的進展，但這疫苗的局限性也很明顯。ETEC的菌毛抗原種類較多，而且地域分布差異較大，使得研制安全有效的疫苗變得更加困難。目前許多ETEC疫苗大部分只包括了部分菌毛黏附素和腸毒素，對動物的免疫效果不夠全面，缺乏廣譜性，以期通過對免疫方式、抗原類型及疫苗形式的優化，更好地誘發機體全身和黏膜免疫反應。基因工程技術的應用不僅能增強疫苗免疫的效果及安全性，通過對多種抗原的融合還增加了疫苗防護的廣譜性，具有較好的研究前景，這對于ETEC感染的預防具有十分重要的意義。