雞球蟲毒力致弱方法及其在雞球蟲病弱毒活疫苗研發上的應用

尹理君，廖申權，孫銘飛，宋忠峰1,，侯曉礁，李福元，呂敏娜，吳彩艷，李娟，林栩慧，蔡海明，胡俊菁，于林增，肖文婉，張健騑，戚南山 *，顧有方

(1. 安徽科技學院動物科技學院，安徽 鳳陽 233100；2. 廣東省農業科學院動物衛生研究所/嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室茂名分中心/農業農村部獸用藥物與診斷技術廣東科學觀測實驗站/廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，廣東 廣州 510640；3. 北京生泰爾科技股份有限公司，北京市中獸藥工程技術研究中心，北京 100260)

雞球蟲病是由一種或多種艾美耳球蟲引起的腸道寄生蟲病，可嚴重影響受感染雞群的增重和飼料轉化利用率，雛雞感染球蟲時可造成高發病率及致死率，愈后雞也存在生長不良，生產性能下降等問題，嚴重危害養雞業的發展，據估計全球養雞業每年因雞球蟲病可造成超過30億美元的經濟損失[1]。近年來，大規模集約化的飼養模式更加有利于雞球蟲的傳播與感染，導致雞球蟲病發病率顯著增高[2]。

自上世紀60年代，一些化學合成藥物、聚醚離子載體類藥物已被廣泛應用于雞球蟲病的預防和控制，但因為抗球蟲藥的長期使用及一些不合理用藥等情況，導致雞球蟲幾乎對現有抗球蟲藥均產生了不同程度的耐藥性，部分蟲株甚至產生不同程度的交叉耐藥現象[3]。雞球蟲耐藥蟲株的出現嚴重影響了抗球蟲藥物的使用效果，在田間蟲株耐藥性情況不清晰的情況下使用抗球蟲藥，極有可能造成雞球蟲病的大規模暴發。同時因抗球蟲藥的長時間使用，導致的藥物殘留問題嚴重影響家禽產品質量[4]。雞球蟲病活疫苗是目前可替代抗球蟲藥物防控雞球蟲病的重要方法之一，目前常用的雞球蟲病活疫苗主要包括強毒活疫苗和弱毒活疫苗。球蟲強毒活疫苗是由強毒且免疫原性好的蟲株，按一定的配比研制而成。強毒活疫苗由于其蟲株毒力較強，存在散毒的風險，其使用存在一定的局限性[5]。而弱毒活疫苗是通過人為方法減弱艾美耳球蟲蟲株的致病性所得到的弱毒蟲株而制成的活疫苗，它可以降低對宿主的危害，穩定性能好，安全性高，同時擁有著良好的免疫原性。目前關于雞球蟲病弱毒活疫苗的研制手段主要是通過理化致弱、雞胚傳代和早熟選育等方法，可獲得致病力弱、免疫原性好的弱毒蟲株[6]。鑒于國內缺乏相關致弱方法的系統性綜述，本文旨在對球蟲強毒蟲株毒力的相關致弱處理方法及其在弱毒球蟲疫苗研制中應用現狀進行概述。

1 雞胚傳代致弱法

1.1 雞胚傳代的背景

國外學者Long[7]首先報道了柔嫩艾美耳球蟲能在發育的雞胚內生長，證明球蟲在雞胚中連續培養、傳代能導致雞胚適應株的產生。于1972年Long首次用雞胚傳代方法對野生型強毒株球蟲進行毒力致弱處理，培育出柔嫩艾美耳球蟲致弱株“TA株”。國內最早由楊振中等[8]學者采用雞胚傳代的方法對柔嫩艾美耳球蟲(上海天山株)進行致弱處理，培養出了柔嫩艾美耳球蟲致弱蟲株，并于1984年完成了實驗室研究，試制成弱毒活疫苗。Shirley[9]將毒害艾美耳球蟲卵囊脫囊后獲得的子孢子接種到雞胚，并通過雞胚反復傳代，培育出第一個雞胚適應株球蟲，并發現該雞胚適應株對雞的致病性明顯低于親本株，但仍保留了良好的免疫原性。樊生超等[10]用雞胚傳代的致弱方法將柔嫩艾美耳球蟲經過32代雞胚傳代，得到柔嫩艾美耳球蟲實驗蟲株，通過雞體毒力回歸試驗表明實驗蟲株與親本株相比，其毒力明顯降低，可用于制備雞球蟲病活疫苗的研究。謝明權等[11]用雞球蟲子孢子接種雞胚，采用加大接種劑量和增加接種胚數的方法，使球蟲逐漸適應雞胚，傳至24代，培育柔嫩艾美耳球蟲體外繁殖雞胚適應株。樊玉娟等[12]通過雞胚傳代對柔嫩艾美耳球蟲傳代條件進行研究，探究出了柔嫩艾美耳球蟲的雞胚培養條件并建立了柔嫩艾美耳球蟲雞胚適應株。

1.2 雞胚傳代的原理

雞胚傳代減毒的原理是通過人工措施使雞球蟲卵囊在體外達到脫囊效果，從而得到一定數量的子孢子，然后將子孢子接種到雞胚絨毛尿囊膜上繼續培養，繁殖得到更多的后代卵囊，將其孢子化后通過雞胚連續傳代多次，從而獲得對雞致病力大大降低、免疫原性好的“雞胚適應株”[13]。其強毒株毒力得到致弱主要是由于第2代裂殖體從原來的黏膜固有層轉而全部寄生到了腸腺上皮細胞，對組織損傷較小。

1.3 雞胚傳代的優勢與局限

通過雞胚傳代的方法獲得的雞胚適應株，對雛雞的致病力減弱，可使雛雞抵抗強毒株的攻擊。但其致弱性能相對不穩定，當轉為雞體傳代時毒力返強較快。大批量生產商品化弱毒卵囊比較困難，如堆型、巨型艾美耳球蟲等流行性強的球蟲不易在雞胚中發育，生產全價致弱疫苗會受到很大限制。同時隨著雞胚傳代次數的增加，蟲體的免疫原性可能會減少或完全喪失，很難獲得既能保持良好的免疫力，又可以使毒力致弱的最佳蟲株[14]。

2 理化致弱法

2.1 理化致弱的背景

早在1991年國外學者Jenkins等[15]發現用15 Krad X-射線和12 Krad γ-射線分別處理堆型和巨型艾美耳球蟲卵囊，可明顯減弱卵囊毒力，并發現用輻射減毒的卵囊免疫接種仍可以誘導雞體產生保護性免疫反應。顧有方等[16]用重鉻酸鉀、氯化鈉、碳酸氫鈉、葡萄糖、氯化鉀、疊氮鈉和蒸餾水等制備了強毒雞球蟲致弱劑，可成功致弱柔嫩、堆型、早熟、巨型和毒害等艾美耳球蟲。劉春杰[17]用物理方法和化學方法將柔嫩艾美耳球蟲混合株致弱，首先將孢子化卵囊在一定功率不同超聲時間的超聲波作用下致弱，然后配制化學致弱劑，將孢子化卵囊和化學致弱劑攪拌混合均勻進行致弱，獲得了柔嫩艾美耳球蟲致弱混合株。劉蕾[18]以紫外線照射對柔嫩艾美耳球蟲YL株進行致弱，發現經紫外線照射過的球蟲卵囊相比未經過紫外線照射過的卵囊對雞體的影響較小，癥狀和病理變化較輕,且沒有死亡現象。李丹青等[19]采用雙重致弱的方法，由柔嫩、毒害和巨型三種艾美耳球蟲分離、純化、培養后的孢子化卵囊采用烷化劑類化學誘變劑進行致弱后，又采用紫外線照射物理誘變因素再次進行致弱，得到雙重致弱株，其誘變率高，毒力低，免疫效果穩定。

2.2 理化致弱的原理

理化致弱強毒株主要是通過冷卻、加熱、離子輻射、超聲等物理或化學誘變劑等方式處理，使強毒株的毒力有所下降，從而達到減毒的目的。但因理化方法處理可能會造成卵囊的破壁、失活等，通過這些方式致弱處理可能是殺死了部分孢子化卵囊，減少了接種雞體卵囊的實際數量，而非真正降低了艾美耳球蟲的致病性，達到弱毒的效果。

2.3 理化致弱的優勢與局限

通過理化致弱的方法產生的卵囊，毒力明顯減弱，用減毒的卵囊進行免疫接種時，可以誘導宿主產生保護性免疫反應。但通過輻射處理得到的弱毒卵囊的裂殖發育階段幾乎完全中止，且隨著輻射代次增加，卵囊的致病性會恢復正常。

3 早熟卵囊選育法

3.1 早熟選育的背景

早熟選育的方法最早是由Jeffers[20]提出并建立了早熟蟲株的選育過程及相關研究方法的，隨后通過此方法成功選育出了柔嫩、堆型、毒害、早熟、和緩和巨型艾美耳球蟲等早熟弱毒品系。與親本株相比早熟株毒力顯著減弱，卵囊產量減少，內源發育周期中第三代裂殖體幾乎完全缺失或數量減少。Shirley等[21]用分離出的布氏艾美耳球蟲單卵囊進行雞體傳代，再用收取的潛隱期卵囊經過27代早熟選育，得到了生活史明顯縮短的布氏艾美耳球蟲早熟品系。王時偉[22]通過選擇提前發育成熟的卵囊，獲得布氏艾美耳球蟲湯陰株的早熟株，經16代選育，最小潛隱期從119 h減少到90 h。索勛[23]按照早熟系選育方法對和緩艾美耳球蟲涿州株進行了早熟選育，經石歧雜肉仔雞15次傳代后，潛隱期縮短了19 h，由親本株的96 h縮短至77 h，其選育出的和緩艾美耳球蟲涿州株早熟系在致病性與繁殖力上均較親本株弱，但保留了親本株的免疫原性。崔平等[24]通過對6株田間巨型艾美耳球蟲早熟選育，經20次傳代,獲得了遺傳性狀穩定，潛隱期由156 h縮短至132 h的巨型艾美耳球蟲早熟株。劉麗丹等[25]通過雞體對和緩艾美耳球蟲保定株連續11代的早熟選育后，獲得了潛隱期由97 h縮短至82 h的早熟系。

3.2 早熟選育的原理

雞球蟲感染產生的卵囊在雞體內連續早熟選育傳代產生的蟲株，由于裂殖期的裂殖代數的減少使球蟲的生活周期可以快速完成，最后一代裂殖子的缺失或減少顯著降低早熟品系的致病力，使得早熟株不僅具有生命周期縮短的特點，而且具有明顯的毒力減弱的特征[26]。早熟選育法就是運用此原理用單卵囊分離法獲得球蟲卵囊，卵囊孢子化后接種雛雞，收集感染后最先排出的卵囊，重復傳代，不斷選育獲得早熟品系[27]。早熟株致病力減弱的原因是第二代裂殖體沒有完全分化或在成熟時變得非常小，絕大多數只經歷了1～3代的裂殖生殖，缺少完整的裂殖生殖階段，在宿主中完成內生性發育比野生型親本蟲株更快，使之毒力變弱。

3.3 早熟選育的優勢

早熟株與親本株相比潛隱期明顯縮短，致病力明顯降低[28]。早熟品系的致病性明顯低于強毒親本株，隨著連續數代的早熟選育，獲得的早熟株減毒作用保持穩定；對于各種球蟲的選育，持續傳代，直到常規劑量下早熟品系對受感染雞群的體增重沒有影響或產生的影響非常微小。如Paracox-8疫苗，七種弱毒早熟株按照一定配比混合，對接種的雞群也不會產生不良反應。

早熟株有著良好的早熟特性，能保持較好的免疫原性。廖貴城等[21]等對布氏艾美耳球蟲進行了20代早熟選育，其致病力與繁殖力均比親本蟲弱,而免疫原性不變，并保持了遺傳穩定性。張志敏等[30]通過研究選育了柔嫩艾美耳早熟株，并對早熟株和其親本株卵囊的生物學特性進行了研究，結果發現，早熟株的免疫原性要好于親本株。

4 致弱方法在雞球蟲病疫苗研發上的應用

1951年，第一個適用于種雞和蛋雞的商品化雞球蟲病強毒活卵囊疫苗Coccivac-D在美國上市,次年其研發出含有堆型、巨型、變位和柔嫩艾美耳球蟲強毒株雞球蟲病活卵囊疫苗Coccivac-B。第二種商品化雞球蟲病活卵囊疫苗是1985年加拿大研發的Immucox-C1、Immucox-C2強毒活疫苗，Immucox-C1和Immucox-C2活疫苗均為未經致弱的自然毒力株按一定劑量配制的強毒苗，兩者僅所含球蟲種類稍有差異。由荷蘭Intervet公司生產的強毒活疫苗Nobilis Cox包含有堆型、柔嫩和兩種巨型艾美耳球蟲，其通過飲水或噴霧接種肉雞。英國Houghton實驗室運用早熟選育的致弱方法于1989年成功研制出第一個雞球蟲病弱毒活卵囊疫苗Paracox-5和Paracox-8，前者包含柔嫩、堆型、和緩和兩個不同的巨型艾美耳球蟲早熟品系，后者是一種全價疫苗，包含了柔嫩、堆型、早熟、毒害、和緩、布氏以及兩株不同免疫原性巨型艾美耳球蟲早熟品系。捷克公司以雞胚傳代和早熟選育相結合的方法，于1992年研制出Livacox-T、Livacox-Q弱毒活卵囊疫苗，Livacox-T含有堆型和巨型艾美耳球蟲早熟品系，同時含有柔嫩艾美耳球蟲雞胚適用品系，Livacox-Q與其相比增加了毒害艾美耳球蟲早熟品系[31]。由澳大利亞BioProperties公司通過早熟選育的方法研制生產的Eimeriavax弱毒活疫苗，包含了柔嫩、毒害、巨型和堆型艾美耳球蟲弱毒株，可通過滴眼的方法給予肉仔雞、蛋雞和種雞。中國從20世紀80年代開始研究雞球蟲病弱毒活疫苗的研發，最早由中國農科院上海家畜寄生蟲病研究所生產的雞球蟲病三價活疫苗是通過理化雙重致弱的方法對柔嫩、毒害和巨型艾美耳球蟲自然毒力株進行減毒，實現強毒株致弱的目的。由北京農學院研制的雞球蟲病三價活疫苗是運用早熟選育的方法進行致弱處理的，其含有柔嫩、堆型和巨型艾美耳球蟲早熟品系，其研制的雞球蟲病四價活疫苗是包含柔嫩、堆型、巨型和毒害艾美耳球蟲早熟品系。正典生物技術有限公司以早熟選育技術于2007和2012年分別研發了雞球蟲病四價活疫苗和雞球蟲病三價活疫苗，其雞球蟲病四價活疫苗包含了柔嫩、巨型、毒害和堆型艾美耳球蟲四種早熟致弱品系，其雞球蟲病三價活疫苗與雞球蟲病四價活疫苗相比少了毒害艾美耳球蟲早熟致弱品系。齊魯青大生物制藥有限公司于2016年上市雞球蟲病三價活疫苗(商品名為球貝)，該疫苗由柔嫩艾美耳球蟲早熟弱毒株、巨型與堆型艾美耳球蟲自然弱毒株混合制成[32]。于2019年獲得新獸藥證書的廣東省農業科學院動物衛生研究所雞球蟲病四價活疫苗，是由柔嫩、毒害艾美耳球蟲早熟減毒株和堆型、巨型艾美耳球蟲自然弱毒株配比制成[33]，見表1。

表1 國內外商品化球蟲疫苗

5 結語

目前，隨著現代養雞業規模化、集約化生產快速發展的同時，同樣伴隨著雞球蟲對各種抗球蟲藥產生耐藥性，藥物殘留及藥物生產成本高等問題，使用雞球蟲病免疫預防成為防控雞球蟲病的有效手段，其中雞球蟲病弱毒活疫苗有著致病力弱，穩定性能好，安全性高，免疫原性好等優點，使得球蟲致弱蟲株的選育成為弱毒疫苗研制的關鍵。由于雞胚傳代致弱和理化致弱的方法存在眾多局限性，而通過早熟選育的方法獲得的致弱蟲株具有致病力弱、免疫原性好、遺傳穩定等諸多優點,因此多數學者更傾向于利用早熟選育法進行球蟲致弱蟲株的選育。現階段雞球蟲病的防控面臨嚴峻挑戰，研制高效、安全的雞球蟲病活疫苗將為養雞業的可持續健康發展提供一定的保障。