8種試劑盒的水稻DNA提取效果比較研究

肖婉鈺 孫藝嘉 周賢玉 任海龍 鄒集文 張晶 許東林

摘? ? 要：水稻種子DNA的提取質量直接影響水稻種子真實性檢驗的效果。選取市面上常見的8種植物基因組DNA提取試劑盒（K1～K8）進行水稻種子DNA提取效果比較研究，結果表明，試劑盒K2提取得到的水稻種子DNA在0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測中，條帶最明亮、整齊且無拖尾，質量最高，試劑盒K8、K3的提取質量次之;試劑盒K1、K6提取的水稻種子DNA純度最佳，試劑盒K2、K3、K5、K7、K8的提取產物純度次之。因此，試劑盒K2的提取效果最好，K8、K3次之，8種試劑盒均適用于基于SSR片段分析的水稻品種真實性檢測。

關鍵詞：水稻;DNA提取試劑盒;品種真實性

文章編號：1005-2690（2021）18-0005-02? ? ? ?中國圖書分類號：S511? ? ? ?文獻標志碼：B

種子真實性檢測是加強知識產權保護、促進種業健康發展的保障[1]。目前，我國水稻、玉米等大宗農作物已普遍開展種子真實性檢測，無論是目前主流第二代分子標記即SSR（簡單重復序列）的檢測方法，還是新一代SNP分子標記的檢測方法，都需要高質量的基因組DNA作為基礎。因此，確保植物DNA提取的質量是種子真實性檢測能否保質保量完成的關鍵因素。

在種子真實性檢測中，選取的材料大多為水稻新鮮葉片、幼苗或水稻幼嫩莖 [2-7]。但將水稻的種子播種，發苗之后再進行核酸抽提耗時太久，如能直接用水稻種子抽提核酸，將大大提升試驗效率，但是在水稻的各部位組織中，種子稻米的成分最為復雜，含更多的淀粉等物質，所以提取水稻種子基因組DNA 難度更大。通過比較不同DNA試劑盒水稻種子DNA的提取效果，旨在為今后種子真實性檢測提供技術支持。

1? ?材料和方法

1.1? ?試驗材料

以10個雜交水稻品種的干種子為試驗材料，材料均來自于2020年廣東省種子監督抽查的備份樣品。試驗樣品編號如下，A：深優9516，B：野香優莉絲，C：恒豐優778，D：荃優絲苗，E：創優華占，F：隆優3206，G：廣8優金占，H：軟華優6100，I：廣8優金占，J：恒豐優387。

1.2? ?單粒種子DNA提取

取 1 粒水稻干種子，用MP FastPrep-24組織勻漿器磨成粉末，再用8種DNA提取試劑盒（見表1）分別提取上述10個水稻品種的DNA，按照每種試劑盒中的使用說明來進行提取，共獲得80個水稻基因組DNA。

1.3? ?DNA產物質量測定

1.3.1? ?瓊脂糖凝膠電泳檢測

用超純水將80個DNA模板稀釋到50 ng/μL，吸取5 μL DNA 與1 μL 上樣緩沖液混勻， 0.8%的瓊脂糖凝膠，85 V電壓，電泳20 min，用Proteinsimple AlphaImager HP凝膠成像系統上觀察和拍照。

1.3.2? ?DNA 質量濃度和純度的測定

用Thermo Scientific NanoDrop One超微量分光光度計檢測80個DNA 模板的質量濃度和純度。其中A260/A280的大小代表DNA 純度;DNA 模板在260 nm?的吸光度代表DNA 質量濃度，A260=1代表DNA 質量濃度為50 ng/μL[8]。

1.4? ?水稻SSR的PCR擴增與毛細管電泳檢測

引物來自于2014 年原農業部水稻品種鑒定標準《水稻品種鑒定技術規程：SSR 標記法NY/T 1433—2014》。選用5 對引物進行PCR 擴增，見表2。

20 μL 反應體系：10×buffer 2μL，dNTP0.5 μL，Taq酶0.5 μL，10 μmol/L的正向熒光引物1 μL，1 μL 10 μmol/L的反向普通引物，50 ng/μL 的模板DNA1 μL，加無菌水補齊至20 μL。

擴增條件：預變性94 ℃ 4 min;變性94 ℃ 45 s，退火50～67 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 1 min，30 個循環;72 ℃延伸8 min。

上機準備：PCR 結束以后，取一塊96 孔板加入70%乙醇至總體積為50 μL，震蕩充分混勻。3 700 r/min，4 ℃離心30 min。靜置15 min 后加入內標LIZ500 和HiDi，振蕩充分混勻，離心10 s。放入PCR 儀，95 ℃ 條件下4 min 變性。放到Thermo Scientific ABI 3500中進行毛細管電泳。

2? ?結果與分析

2.1? ?DNA 提取物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果

由圖1可見，試劑盒K2呈現出整齊清晰的條帶，無拖尾現象;試劑盒K3和K8條帶亮度較弱，也無拖尾現象;試劑盒K7條帶明亮，但拖尾現象嚴重;試劑盒K1、K4、K5、K6條帶亮度很弱，有明顯拖尾現象。

2.2? ?DNA提取物濃度和純度檢驗結果

由表3可知，8種試劑盒提取方法的DNA質量濃度中，試劑盒K7的濃度為25.4～266.3 ng/μL，濃度最高;試劑盒K1、K2、K3、K5、K8的DNA質量濃度在18.4～137.4 ng/μL，濃度適中;試劑盒K4、K6的DNA質量濃度低于20 ng/μL，濃度較低。

8種試劑盒提取方法的A260/A280比值情況如下：純DNA 的A260/A280 約為1.8，>1.8 表明有RNA污染，<1.8 表明有蛋白質污染[9-10]。試劑盒K2、K3、K8的A260/A280為1.74～2.06，純度最高;試劑盒K1、K5、K6、K7的A260/A280在1.42～2.29，純度次之;試劑盒K4的A260/A280為1.04～1.74，純度最低。

2.3? ?毛細管電泳結果

在ABI3700 基因分析儀器上利用熒光標記的PCR 產物進行毛細管電泳，8個樣品在5個位點上擴增片段帶型清晰，8個試劑盒的表現一致。

3? ?討論

試劑盒K2、K3、K8提取質量和產量都比較高。采用試劑盒K2、K3、K8提取得到的DNA純度較高，DNA 帶清晰; PCR擴增結果較好，每個引物均可擴增出清晰的波峰，但操作比較煩瑣，耗時耗力，提取10個基因組DNA需2.5 h，所用試劑對人體有毒。與試劑盒K2、K3、K8相比，試劑盒K6步驟簡單，用時少，擴增效果也較好，但DNA 純度較低，也用到了一些對人體有害的試劑，安全性不高。試劑盒K1、K4、K5、K7步驟較復雜，提取得到的DNA純度較低;試劑盒K7的DNA質量濃度太高，需要稀釋才能使用;試劑盒K1、K2、K3、K5、K8的DNA質量濃度適中;試劑盒K4、K6的DNA質量濃度低于20 ng/μL，濃度較低。

在進行SSR-PCR 反應中，模板DNA 如果含有多糖、酚類、蛋白質等雜質[10]， 會影響DNA 聚合酶活性，干擾引物與模板的結合。試劑盒K2提取的數量多，PCR 結果穩定，重復性也好， 在進行水稻干種子DNA 抽提時，試劑盒K2是實驗室提取水稻基因組DNA 的一種好方法。

通過對8種DNA提取試劑盒提取10個水稻品種的DNA進行DNA提取試劑盒篩選，結果表明，試驗篩選出最優DNA提取試劑盒具有穩定、高效和可重復性的特點，可應用于水稻真實性檢測工作。

參考文獻：

[ 1 ] OECD.Consensus document on compositional considerations for new varieties of rice（Oryza sativa）：key food and feed nutrients and antinutrients[R].Paris：OECD，2004.

[ 2 ] 李炫麗，王世才，許雙全.水稻單粒種子DNA提取及SSR-PCR反應體系的正交設計優化[J].中國種業，2011（8）：46-49.

[ 3 ] IKEDA N，BAUTISTA N S，YAMADA T.Ultra-Simple DNA extraction method for marker-assisted selection usingmicro-

satellite markers in rice[J].Plant Molecular Biology Reporter，2001（19）：27-32.

[ 4 ] WU Gang，WU Yuhua，NIE Shujing，et al.Real-time PCR method for detection of the transgenic rice event TT51-1[J].Food Chemistry，2010（119）：417-422.

[ 5 ] 朱世楊，羅天寬，張小玲，等.8種水稻基因組DNA提取方法的比較[J].安徽農業科學，2009（5）：1929-1931.

[ 6 ] 趙紅霞，謝攀，黃志堅，等.一種改良的水稻總DNA提取方法[J].湖北大學學報（自然科學版），2006（4）：389-392.

[ 7 ] COLLARD B C Y，DAS A，VIRK P S，et al.Evaluation of quick and dirty DNA extraction methods for marker-assisted selec-

tion in rice（Oryza sativa L.）[J].Plant Breeding，2007（126）：47-50.

[ 8 ] CHAPELA M J，SOTELO C G，PEREZ-MARTIN R I，et al.Comparison of DNA extraction methods from muscle of canned

tuna for species identification[J].Food Control，2007（18）：1211-1215.

[ 9 ] SHARMA A D，GILL P K，SINGH P.DNA isolation from dry and fresh samples of polysaccharide-rich plants[J].Plant Mol Biol Rep，2002（20）：415.

[ 10 ] 李娟，文建成，譚學林.從水稻單粒糙米中快速制備基因組DNA的方法[J].分子植物育種，2007（5）：735-737.