藥用植物懸浮細胞培養技術研究進展

胡珊群 梁汝黛 李彤 王晨 劉長利

摘? ? 要：近年來，隨著我國中醫藥事業的持續發展，藥用植物次生代謝產物的應用途徑逐漸增多，藥用價值和經濟價值逐年上升，其市場需求量也持續增長，而藥用植物野生資源蘊藏量下降、生態環境破壞等問題使得藥用植物面臨著嚴重的市場供需矛盾。藥用植物人工栽培面臨著栽培困難、品種退化、成本高昂等難題。采用植物懸浮細胞培養技術，可快速獲得成熟的植物細胞、積累植物中的活性成分，為獲得藥用植物資源開辟了新途徑。簡要介紹了懸浮細胞的最優培養條件和方法、大規模生產懸浮細胞的研究以及懸浮細胞培養技術的前景。

關鍵詞：藥用植物;懸浮細胞;培養條件;植物生長物質;誘導子

文章編號：1005-2690（2021）18-0007-06? ? ? ?中國圖書分類號：S567? ? ? ?文獻標志碼：B

藥用植物的次生代謝產物有極高的藥用價值，比如柴胡皂苷可抗病毒、甘草甜素有免疫調節作用[1]。此類化合物除藥用外也可作為良好的保健品、農藥及化妝品原料，需求量與日俱增。而人工栽培藥用植物對種子、土壤、氣候等條件要求較高，栽培過程中易感染病害、栽培時間長、管理成本高等問題都使藥用植物次生代謝產物供需關系緊張。

植物懸浮細胞培養是一種快速獲得成熟植物細胞及其代謝產物的新技術，運用懸浮細胞培養技術，可以大量生產藥效成分[2]。目前已運用懸浮細胞技術成功獲得包括人參、甘草、厚樸[3-5]等大宗藥材的次生代謝產物。植物懸浮細胞不僅可用于生產藥用活性物質，還能用于遺傳多樣性分析、研究轉基因植物和探究代謝產物生物合成路徑等方面[6]。目前已有200余種植物進行懸浮細胞培養，中國、日本、德國已成功進行人參、紫草等植物的大規模生產，能夠滿足人參、皂苷等植物次生代謝產物的市場需求[7]。

植物懸浮細胞培養技術可在人工精確設計下獲得藥用植物細胞及其代謝產物，不僅能緩解藥用植物資源緊缺的問題，還能減少對土地資源的占用，是獲取藥用活性成分、保護藥用植物資源的重要手段。盡管國內外已經進行了懸浮細胞培養的初步嘗試，但是此技術還需要不斷優化和改進。本文將對懸浮細胞的最優培養條件和方法、大規模生產懸浮細胞的研究以及懸浮細胞培養技術的前景進行綜述。

1? ?懸浮細胞制備

獲得植物懸浮細胞的操作流程如圖1所示，建立良好的懸浮細胞培養體系受多方面因素影響，確定各因素的最佳條件是成功建立及優化懸浮細胞培養體系的關鍵。

懸浮細胞的制備是建立良好的懸浮細胞體系的基礎，制備流程主要包括選擇外植體、選擇最佳誘導愈傷部位、選擇最佳愈傷狀態、懸浮細胞的篩選和繼代4個方面。

外植體的選擇能夠影響細胞的生長，適宜的外植體可誘導出胚性愈傷率和再生率較高的體系，更容易建立起高頻再生的懸浮細胞系[8-18]。部分植物的最佳外植體誘導部位見表1，說明不同的植物對誘導部位的選擇差異較大。

而同一植物的不同部位所誘導的愈傷組織狀態也不同，祖恩凡等[19]研究發現金銀花的嫩莖能誘導出活力最佳的愈傷組織，因此選擇合適的外植體部位才能誘導出生長良好的愈傷組織，從而構建良好的懸浮細胞培養體系。

試驗所得的愈傷組織通常有3種類型：Ⅰ型為質地堅硬、塊狀、顏色鮮黃的胚性愈傷組織;Ⅱ型為質地疏松、易分散、不分泌黏液的顆粒狀胚性愈傷組織，外觀往往呈現淡黃綠色;Ⅲ型為柔軟、水漬、形狀不規則、顏色淡白的非胚性愈傷組織。懸浮細胞系的建立通常選擇Ⅱ型愈傷組織作為建立懸浮細胞系的材料。在培養朱砂根、印楝、何首烏、油棕、相思樹等[20-24]植物的懸浮細胞時，均使用到質地疏松、分散、不分泌黏液的顆粒狀胚性愈傷組織進行懸浮細胞的培養。愈傷組織的細胞結構隨著繼代次數的增加逐漸變得疏松，且細胞體積增大，畸形細胞明顯增加。這表明，愈傷組織中的細胞逐漸由胚性愈傷組織轉化為非胚性愈傷組織。張靜等人對山西野葛懸浮細胞的研究顯示，選用繼代第三次的愈傷組織進行懸浮細胞培養的野葛[25-26]總黃酮含量最高。

為得到均一性、分散性良好且生長旺盛的懸浮細胞系，在繼代時需對懸浮細胞進行篩選，得到均一性、良好的細胞系。目前主要操作的方法有小細胞團篩選法、直接傾倒法和移液管接種法[27]。小細胞團篩選法指用不銹鋼網或尼龍網[28]篩選細胞團，收集小細胞進行繼代培養。在對刺山柑[29]研究中發現，隨細胞團直徑增加，細胞中總黃酮含量下降[30-31]。

懸浮細胞的生長曲線為S型，分為延滯期、對數生長期、穩定期及衰亡期4個階段。3種植物的生長周期見表2，對數生長期后，由于培養基中的營養物質減少，細胞開始代謝積累有害物質，使細胞生長速度減慢。不同植物的懸浮細胞生長周期不同，但繼代培養都應選擇在對數生長的末期或穩定期進行。

2? ?培養條件

對懸浮細胞中次生代謝物的產生影響較大的是懸浮細胞的培養條件，主要包括兩個方面，一個是培養基的選擇，另一個是外部條件的控制，包括pH值、溶氧水平等。

2.1? ?培養基的選擇

培養基成分主要包括基礎培養基、大量元素、植物生長物質、前體物質和誘導子。目前，建立或優化植物懸浮細胞培養體系時，多就植物生長物質和誘導子的種類和濃度進行研究。

常見的培養基種類有B5、MS、White、N6等，郭紫娟[32]發現，三七的懸浮細胞細胞干重增長量在B5培養基中比在MS培養基中高1.25 g/L。因此選擇合適的基礎培養基有助于提高次生代謝產物的含量。植物培養基中的大量元素包括碳、氮、磷等，碳源是植物細胞生長過程中主要的營養物質來源。氮源在細胞生長過程中主要用于合成蛋白質與核酸等細胞物質。磷是組成生物遺傳因子與諸多代謝相關輔酶的重要元素。為更好地促進懸浮細胞的生長和代謝，應當注意大量元素的使用濃度。蔗糖不僅是培養液中碳源的主要來源，還能夠維持培養基滲透壓。糖的濃度過高易導致細胞失水，產生褐化反應[33]。研究發現，培養基中蔗糖的濃度在28 g/L時，三七幼葉的懸浮細胞干重增長量達到最高[34]。

常用的植物生長物質有6-苯甲基腺嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA），萘乙酸（1-naphthylacetic acid，NAA），2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D），激動素（Kinetin，KT）等，選用不同的生長物質，對懸浮細胞影響不同。在MS培養基中添加6-BA和2，4-D時，白木香懸浮細胞的生長情況最好，而添加NAA的培養基中，白木香的懸浮細胞出現了褐化現象，細胞鮮重出現負增長[35]。此外，同一生長物質的不同濃度對懸浮細胞的生長也有影響，如紫蘇懸浮細胞的干重及迷迭香酸的含量隨6-BA的使用濃度先增加后減少[36]。目前研究發現，植物生長物質對懸浮細胞生長代謝的影響有以下兩種情況：①低濃度促進懸浮細胞的生長代謝，高濃度抑制懸浮細胞的生長代謝。②在各個濃度下均抑制懸浮細胞的生長代謝。值得注意的是，植物生長調節劑有一定毒性。NAA能夠抑制小鼠肝細胞增殖并促進肝細胞凋亡，使小鼠體重減輕[37]。2，4-D是一種常用的除草劑，能降低小鼠精子質量，引起生殖毒性損傷[38]。因此在提取懸浮細胞內代謝產物時，必須洗凈懸浮細胞上的液體培養基。在篩選植物生長物質的使用濃度時，可進行正交試驗，這樣在降低試驗成本的同時可研究各激素之間的協同或拮抗作用。

誘導子可以促使植物抗毒素信號形成，將誘導子應用于植物細胞培養可提高目標代謝產物的含量，是國內外研究的熱點之一。誘導子主要分為生物誘導子和非生物誘導子。常見的非生物誘導子[39-45]有茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate，MeJA）、水楊酸（Salicylic acid，SA）、重金屬鹽、稀土元素等，目前國內外對MeJA和SA的研究比較多。段永波等研究發現蜀葵的懸浮細胞內總黃酮的含量隨MeJA使用濃度的增加呈先增加后減少的趨勢。MeJA和SA處理均能顯著促進生物堿在半夏懸浮細胞中的累積，150 μmol/L的MeJA和50 μmol/L的SA分別處理可以使半夏生物堿含量為對照組的3.6倍和2.5倍。適當濃度的金屬離子可激活一些次生代謝過程中相關酶的活性，增加植物次生代謝產物的積累。范寰等人在培養長春花的懸浮細胞時，發現加入低濃度的Ce4+可增加細胞H2O2的產生和長春質堿的合成，此作用可能是通過激活長春花中的細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）途徑來實現的。生物誘導子包括真菌、細菌、病毒等，目前對植物內生真菌的研究較多。內生真菌可能是道地藥材形成的原因之一，內生真菌可能通過參與細胞代謝途徑調節懸浮細胞的生長。在對宜賓當地油樟懸浮細胞的研究發現，其內生真菌可通過影響H2O2通路來調節揮發油的代謝，在添加40 mg/L內生真菌后，懸浮細胞中揮發油的含量約為對照組的2.0倍。

前體物質[46-48]是合成次生代謝產物的前提條件，在植物懸浮細胞培養過程中加入不同種類、濃度的前體物質，會對目標次生代謝產物的合成產生不同的影響。紫杉醇合成的前體物質苯丙氨酸、苯甲酸鈉及乙酸鈉對紅豆杉懸浮細胞的紫杉醇產量有顯著影響。當在培養基中分別加入15 mg/L苯丙氨酸及30 mg/L苯甲酸鈉時，紅豆杉懸浮細胞中的紫杉醇產量分別提高了21.76%和26.14%。

2.2? ?外部條件的控制

制備生長狀態良好的懸浮細胞，選擇最適培養基是進行懸浮細胞培養的重要準備工作，而控制合適的外部條件也是懸浮細胞長期生長和次生代謝產物積累的必要條件。外部條件主要包括培養液的pH值和溶氧水平、溫度及光照條件。

一般藥用植物細胞生長最適pH值范圍為5.8～6.0。培養基的pH值對懸浮細胞的影響很大，過酸或過堿的環境都會加劇懸浮細胞的褐化甚至引起懸浮細胞死亡，因此在配制懸浮細胞的培養液時應調節其酸堿度，使其適合懸浮細胞生長。劍麻及南方紅豆杉[49-50]懸浮細胞在pH值為5.8時長勢最好。也有一些細胞的最適pH值偏大，Malik等[51]研究發現，適合紫草細胞生長及紫草寧衍生物形成的pH值為7.25～9.50。除了pH值之外，培養液的溶氧量也影響懸浮細胞的生長。在培養懸浮細胞時，通常通過改變搖床轉速和培養液體積調節溶氧量。液體培養基的溶氧量和細胞分散度與轉速呈正相關，最適的轉速在100～150 r/min范圍內。徐薯[52-53]的懸浮細胞對轉速敏感，當搖床轉速為100 r/min時，徐薯懸浮細胞的生長速度最快。適宜的裝液量有利于在離心力的作用下使懸浮細胞分散，從而促進細胞生長，能夠為懸浮細胞提供足夠的生長空間和溶氧量。程玉鵬等[54]在建立柴胡懸浮細胞的培養體系時發現，固定接種量（2 g）和培養瓶容積（250 mL），將培養基體積從50 mL逐步增加至100 mL時，細胞增重量明顯增加，若持續增加培養基體積，細胞增重量則明顯下降;當固定轉速，愈傷組織接種量在2.0 g，培養液體積占容器的2/5時，細胞鮮重增至最大。

培養植物懸浮細胞時，次級代謝產物合成的最佳溫度為20～28 ℃。當培養溫度與植物細胞正常生長所要求的溫度相差很大時，可引起某些應激效應，或對次級代謝產物積累產生激活作用。不同植物對溫度的需求不同，部分植物懸浮細胞生長所需的最佳溫度和懸浮細胞代謝所需的最佳溫度不同，是因為溫度對植物細胞生物合成途徑中相關基因表達和調節物質有影響。對葡萄懸浮細胞[55]的研究表明，在38 ℃時，葡萄懸浮細胞中褪黑素生物合成的相關基因色氨酸脫羧酶（Tryptophan decarboxylase，TDC），血清素N-乙酰基轉移酶（Serotonin N-acetyltransferase，SNAT）和N-乙酰基-5-羥基色胺-甲基轉移酶（N-acetyl-5-hydroxytryptamine-methyl transferase，ASMT）的表達量有明顯上調。牛曉娟等[56]研究不同溫度對石斛懸浮細胞的影響，發現在31 ℃條件下培養的石斛懸浮細胞的增殖系數最小;而當溫度為25 ℃時，隨著培養天數的增加，石斛懸浮細胞的增殖系數增大。除溫度外，藥用植物細胞在懸浮培養時可通過調節光照時間[57]的長短、光質和光的強度來增加次生代謝產物的積累。在光照時間12 h/d、光照1 200 lx時，仙茅懸浮細胞干重和仙茅苷含量均處于較高水平，分別是黑暗組的1.85倍和2.18倍。光照對懸浮細胞的影響可能與光信號轉錄因子引起的基因調控有關。李漢生等[58]的研究發現，藍光照射培養的龍眼懸浮細胞比黑暗培養的龍眼懸浮細胞生長及代謝更加旺盛，藍光照射組干重比黑暗組多0.28 g/L，比類黃酮含量多0.77 mg/g。光照對懸浮細胞的影響也可能與植物本身的習性有關，因此在進行相關研究時可與原植物對光照的需求進行對比，以得到最適合懸浮細胞生長的光照條件。

3? ?大規模生產懸浮細胞

為實現植物細胞大規模培養、進行次生代謝產物工業化生產，需選用合適的生物反應器，以便于控制物理和化學條件。目前常用的生物反應器類型及其性能對比如表3所示[59-61]。工業大規模生產在選用生物反應器的類型時，需綜合考慮剪切力、混合能力及溶氧能力，剪切力過大會導致細胞褐化甚至死亡;混合能力不足則營養物質不能均勻分布、懸浮細胞分散性差;溶氧能力差則細胞不能與氧氣充分接觸，細胞生長受限。

4? ?討論與展望

植物離體培養技術除細胞懸浮培養外還有愈傷組織培養、不定芽、毛狀根培養等。相較于愈傷組織，懸浮細胞培養使細胞能夠與培養基充分接觸，避免有毒物質在局部大量聚集而影響細胞生長，同時搖培使空氣進入培養基，使細胞更容易生長。與不定芽、毛狀根的培養相比，懸浮細胞的制備則更加簡便。以快速、大量獲取植物活性成分為目的時，懸浮細胞培養技術有較大的優勢。目前這項技術為基因工程在植物細胞水平上的操作提供了理想的材料和途徑。經過轉化的植物細胞再經過誘導分化形成植株，即可獲得攜帶有目標基因的個體。

懸浮細胞培養存在比較大的問題是褐化反應，褐化反應使細胞破損，次生代謝產物減少，主要發生在懸浮培養初期。王佳琦等的研究顯示，甘草細胞的褐化主要由酶促反應引起，其主要機理是植物細胞從固體培養基轉移到液體培養基產生機械損傷，使細胞內多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性增加，細胞內外酚類化合物含量增多，發生氧化反應生成棕色醌類化合物。褐化過程主要受培養體系轉速及滲透壓影響，細胞褐化的程度與轉速正相關，當培養基中不含蔗糖時，細胞不發生褐化反應，但生長緩慢，因此在大規模生產時，可考慮梯度增加蔗糖的濃度和轉速，以避免培養初期的褐化。工業大規模培養時也可適當添加防褐化劑，避免褐化反應。

工業化培養懸浮細胞時還可以用兩步培養法：將懸浮細胞的培養分為兩個階段，第一階段初期在適合細胞生長的培養基中培養懸浮細胞避免褐化反應，第二階段將對數生長末期的懸浮細胞轉移至能夠促進次生代謝產物生成的培養基中生長，這樣能夠有效提高懸浮細胞的次生代謝產物含量[62-63]。

目前建立懸浮細胞培養體系的技術已經非常成熟，對懸浮細胞的研究可將重點放在以下3個方面。

（1）工業化生產方面，優化培養體系，提高次生代謝產物合成量，為工業化生產奠定基礎，以此緩解藥用植物資源緊缺的問題。

（2）代謝途徑研究方面，以懸浮細胞為基礎研究材料，構建轉基因懸浮細胞系，再經誘導轉化成植株，研究植物細胞代謝途徑上相關關鍵酶基因和轉錄因子的功能。

（3）優選作物和資源保護方面，懸浮細胞可通過激素誘導培養成人工種子，進行轉基因植物的研究，篩選出具有抗干旱、抗鹽、可大量繁殖的植物品種，瀕危植物也可以通過建立其懸浮細胞培養體系進行品種保存。

總而言之，懸浮細胞培養技術在藥用植物生產研究中的應用，一方面可以緩解目前藥材資源緊張的情況，另一方面也為藥用植物的代謝途徑研究提供了基礎，最重要的是，利用懸浮細胞技術進行組織培養有利于作物優選和資源保護。

參考文獻：

[ 1 ] 姜雪，孫森鳳，王悅，等.甘草藥理作用研究進展[J].化工時刊，2017，31（7）：25-28.

[ 2 ] 董燕，刁玲武，周聯.藥用植物細胞懸浮培養的影響因素[J].中醫藥信息，2011，28（3）：36-40.

[ 3 ] 黃景嘉，羅眺，湯欽，等.藥用植物人參愈傷組織的誘導培養與懸浮細胞體系建立[J].生命科學研究，2014，18（2）：121-123.

[ 4 ] 李雅麗，孟婷婷，王毛毛，等.甘草細胞在攪拌式生物反應器中的放大培養[J].植物生理學報，2015，51（3）：302-306.

[ 5 ] 陳慧麗. 厚樸細胞培養與超低溫保存的研究[D].福州：福建農林大學，2012.

[ 6 ] 王娟，李金鑫，李建麗，等.植物組織培養技術在中藥資源中的應用[J].中國中藥雜志，2017，42（12）：2236-2246.

[ 7 ] 王沐蘭，楊生超，郁步竹，等.紅豆杉高產懸浮細胞系建立及其紫杉醇誘導的研究進展[J].廣西植物，2016，36（9）：1137-1146.

[ 8 ] 李鑫，李炎林，李清明，等.塊根塊莖類植物細胞懸浮培養技術與應用[J].現代園藝，2017（19）：70-73.

[ 9 ] 王超，姚晨輝，朱林琳，等.桑樹愈傷組織誘導及懸浮細胞系的建立[J].蠶業科學，2016，42（1）：23-29.

[ 10 ] 龍炎杏，張學文，羅莎，等.黃花蒿懸浮培養細胞系的建立及遺傳轉化[J].湖南農業大學學報（自然科學版），2018，44（6）：607-612.

[ 11 ] 劉薇，栗茂騰，朱玉梅，等.藥用植物刺山柑懸浮培養細胞聚集體理化性質研究[J].中國醫藥導報，2008（21）：19-22.

[ 12 ] 李金亭，郭曉雙，王召陽，等.懷牛膝懸浮細胞培養的動力學研究[J].北方園藝，2016（5）：132-136.

[ 13 ] 馬麗娜. 新塔花的快速繁殖與細胞懸浮培養體系的建立[D].烏魯木齊：新疆大學，2019.

[ 14 ] 郭佳祺. 蒺藜懸浮培養體系建立及不同因子對黃酮醇含量影響[D].長春：吉林農業大學，2017.

[ 15 ] 方芳，戴傳超，張波，等.茅蒼術懸浮細胞系建立及內生真菌誘導子對其揮發油積累的影響[J].中草藥，2009，40（3）：452-455.

[ 16 ] 姚喜紅，魏臻武，耿小麗.苜蓿花藥懸浮培養體系的建立及其影響因素[J].草地學報，2010，18（3）：358-364.

[ 17 ] 張玉瓊，陳娜，周建輝，等.石蒜懸浮細胞系的建立及其生物堿累積的研究[J].中草藥，2013，44（24）：3540-3545.

[ 18 ] 戴傳超，余伯陽，薛菲，等.藥用植物大戟懸浮細胞的培養[J].南京林業大學學報（自然科學版），2005（2）：57-60.

[ 19 ] 祖恩凡，趙晨晨，張凌霄，等.金銀花細胞懸浮培養體系的建立研究[J].現代園藝，2019（6）：5-6.

[ 20 ] 鄧素芳，楊旸，賴鐘雄.朱砂根愈傷組織培養及懸浮細胞系建立[J].熱帶亞熱帶植物學報，2012，20（1）：33-38.

[ 21 ] 韓廣建，李興林，別振宇，等.氮素對印楝愈傷組織和懸浮細胞培養的影響[J].天津科技大學學報，2015，30（4）：25-29.

[ 22 ] 邵利. 何首烏懸浮細胞系的建立和穩定同位素示蹤研究二苯乙烯苷合成路徑[D].廣州：華南理工大學，2012.

[ 23 ] 潘登浪，鄒積鑫，曾憲海，等. 油棕細胞懸浮培養及植株再生技術[J].廣東農業科學，2019，46（2）：59-65，173.

[ 24 ] 林秀蓮，葉玲娟，林玉玲，等.相思樹懸浮細胞培養及其細胞形態學觀察[J].熱帶作物學報，2018，39（9）：1786-1793.

[ 25 ] 都曉龍，孫春玉，張美萍，等.繼代次數對吉粳88愈傷組織生理生化指標及細胞形態的影響[J].安徽農業科學，2016，44（5）：155-158.

[ 26 ] 張靜. 山西野葛主要成分含量測定與細胞懸浮培養研究[D].太原：山西大學，2015.

[ 27 ] 胡尚連，尹靜. 植物細胞工程[M].北京：科學出版社，2018.

[ 28 ] 羅月芳，唐婕妤，彭菲，等.益母草懸浮細胞系的建立及轉化外源氫醌生成熊果苷研究[J].中國中醫藥信息雜志，2019，26（2）：80-83.

[ 29 ] 王艷婷，甘露，劉薇，等.藥用植物刺山柑愈傷組織誘導及細胞生長代謝特征研究[J].現代生物醫學進展，2007（12）：1779-1783.

[ 30 ] 劉思妤，楊悅，王鷹，等.北細辛懸浮培養體系的建立及優化[J].草業科學，2017，34（11）：2254-2260.

[ 31 ] 舒孝和，陳志.唐古特大黃細胞懸浮培養中的生理生化特性[J].青海師范大學學報（自然科學版），2009（3）：84-88.

[ 32 ] 郭紫娟.白背三七懸浮細胞培養體系的建立[J].農技服務，2015，32（10）：90-92.

[ 33 ] 王佳琦，牛雯倩，李雅麗，等.甘草細胞懸浮培養初期褐化發生的機理研究[J].河南師范大學學報（自然科學版），2020，48（1）：96-100，108.

[ 34 ] 李濤，李小清，張智慧，等.蔗糖濃度和外源2，4-D與KT濃度對三七幼葉細胞懸浮培養影響的研究[J].西北民族大學學報（自然科學版），2015，36（4）：61-63.

[ 35 ] 吳燕燕，李明，馬婷玉，等.白木香懸浮細胞培養的研究[J].中藥材，2018，41（5）：1044-1047.

[ 36 ] 李會珍，李娜，譚永蘭，等.紫蘇細胞懸浮培養生產迷迭香酸的條件優化[J].中國農學通報，2019，35（28）：32-37.

[ 37 ] 崔靜.萘乙酸對小鼠肝細胞增殖與凋亡的影響研究[D].青島：青島大學，2010.

[ 38 ] 蘇芳菲，胡夢青，梅天資，等.2，4-D對小鼠精子毒性作用的研究[J].南昌大學學報（醫學版），2013，53（1）：13-15，37.

[ 39 ] 別振宇，李興林，汪珊英.誘導子對蜀葵懸浮細胞、不定根培養的影響[J].天津科技大學學報，2017，32（3）：23-28.

[ 40 ] 段永波，魯放，崔婷婷，等.非生物誘導子茉莉酸甲酯和水楊酸對半夏懸浮細胞中生物堿代謝的影響[J].中國中醫藥信息雜志，2017，24（1）：87-90.

[ 41 ] 范寰.Ce4+對懸浮培養長春花細胞次生代謝產物誘導作用的研究[D].天津：天津大學，2007.

[ 42 ] 曹蓉蓉，黨小琳，行冰玉，等.胞內、外Ca2+在水楊酸誘導丹參幼苗迷迭香酸生物合成過程中的作用[J].中國中藥雜志，2013，38（20）：3424-3431.

[ 43 ] 李玉平，李惟雄.微量元素對大花金挖耳懸浮細胞生長與黃酮含量的影響及其化感作用[J].福建農業學報，2019，34（1）：1-8.

[ 44 ] YAN K，ZHENG Y，HU L.Effect of H2O2-Mediated endophytic fungal elicitors on essential oil accumulation in suspension Cells of Cinnamomum longepaniculatum[J].Open Access Library Journal，2020，7（1）：1-10.

[ 45 ] Man Yu，Jing-Chao Chen，Jin-Zhuo Qu，et al.Exposure to endophytic fungi quantitatively and compositionally alters anthocyanins in grape cells[J].Plant Physiology and Biochemistry，2020（149）：144-152.

[ 46 ] 羅月芳，江靈敏，譚朝陽.藥用植物離體培養研究進展[J].中南藥學，2018，16（6）：787-793.

[ 47 ] O.Parra，A.M.Gallego，A.Urrea，et al.Biochemical precursor effects on the fatty acid production in cell suspension cultures? of Theobroma cacao L.[J].Plant Physiology and Biochemistry，2017（111）：59-66.

[ 48 ] 茍莉.前體及誘導子和發酵條件對TMS-26產紫杉醇發酵體系優化[D].楊凌：西北農林科技大學，2014.

[ 49 ] 吳良，張世清，陳河龍，等.劍麻懸浮細胞體系的建立[J].分子植物育種，2019，17（6）：1978-1983.

[ 50 ] 徐志榮，王婷，婁佳蘭，等.南方紅豆杉細胞懸浮培養體系優化及動力學研究[J].林業科學研究，2019，32（1）：8-14.

[ 51 ] Malik Sonia， Bhushan Shashi， Sharma Madhu， et al. Physico-chemical factors influencing the shikonin derivatives pro-duction in cell suspension cultures of Arnebia euchroma （Royle） Johnston，a medicinally important plant species[J].Cell biology international，2011，35（2）：153-158.

[ 52 ] 王欣，閆會，顧向華，等.徐薯55-2的胚性細胞懸浮培養[J].西北農業學報，2014，23（1）：132-137.

[ 53 ] 李雅麗，孟婷婷，張小利，等.甘草細胞放大培養中攪拌式反應器操作策略優化[J].植物科學學報，2015，33（6）：867-872.

[ 54 ] 程玉鵬，林進華，高寧，等.不同因素對狹葉柴胡懸浮細胞生長的影響[J].山西農業大學學報（自然科學版），2016，36（5）：305-309.

[ 55 ] Li-hua Wang，Meng-jiao An，Wei-dong Huang，et al. Melatonin and phenolics biosynthesis-related genes in Vitis viniferacell suspension cultures are regulated by temperature and copper stress[J].Plant Cell，Tissue and Organ Culture （PCTOC），2019（3）：475-488.

[ 56 ] 牛曉娟，林夢瑩，楊德彩，等.不同培養條件對金釵石斛懸浮培養細胞生長的影響[J].貴州師范大學學報（自然科學版），2016，34（5）：33-35.

[ 57 ] 鐘春水，賴鐘雄，賴瑞聯，等.金花茶松散型愈傷組織誘導與懸浮細胞系建立[J].熱帶作物學報，2016，37（3）：476-481.

[ 58 ] 李漢生，姚德恒，陳曉慧，等.藍光對龍眼細胞培養及類黃酮代謝的影響[J].熱帶作物學報，2018，39（4）：694-701.

[ 59 ] 鄒東恢，梁敏.生物反應器的選型原則與設備選型及新發展[J].食品工業，2019，40（4）：244-248.

[ 60 ] 陳永偉，張樂晶.植物細胞培養生物反應器的種類特點及展望[J].種子科技，2017，35（11）：28，30.

[ 61 ] 劉連，王義，史植元，等.植物干細胞培養研究進展[J].生物工程學報，2018，34（11）：1734-1741.

[ 62 ] 李琰，公冶，祥旭，等.雷公藤不定根兩相培養初步研究[J].植物科學學報，2016，34（3）：469-474.

[ 63 ] 胡燕花，張本厚，賈明良，等.間歇浸沒式生物反應器培養鐵皮石斛組培苗[J].中國農業科技導報，2016，18（3）：190-194.