獼猴桃花粉活力測定方法研究

張 鴻，李秀麗，戢小梅，陳 鎮，樂有章，翟敬華，趙志遠，陳志偉

（武漢市農業科學院林業果樹研究所，武漢 430075）

獼猴桃（Actinidia chinensis）是獼猴桃科獼猴桃屬的多年生藤本植物，原產于湖北省宜昌市夷陵區霧渡河鎮。獼猴桃枝繁葉茂，花美且香，是作為庭院公園觀賞植物的上佳選擇，獼猴桃的果實素有“水果之王”之稱，果實含有豐富的獼猴桃堿、單寧、糖類以及大量的氨基酸和維生素等營養物質［1］，此外獼猴桃還能治療壞血病，提高人體免疫力。獼猴桃種植收益高，已經成為中國多個地區的扶貧產業。傳統果樹授粉采用的方式是昆蟲授粉，獼猴桃是半蜜源性植物，當花期相同時蜜蜂會優先選擇其他的蜜源植物，另外，當花期不遇、花期氣候條件差、昆蟲數量較少時往往很難達到優質高產的目的，因此，生產中常需要利用人工授粉來提升果園的產量［2］。人工授粉則需要考慮花粉采集的時間、處理方法和貯藏條件等因素對花粉活力的影響。果樹花粉的生活力能直接影響授粉、受精和坐果，最終決定產量和品質，因此，在人工授粉之前對花粉活力進行檢測尤為重要。目前，對于獼猴桃花粉采集時間、花藥分離時間、干燥方法、貯藏條件、測定方法等方面均有研究［3-6］，但是在獼猴桃花粉制作、不同方法和濃度配比方面的報道比較較少。本研究從花粉制作、檢測方法、濃度配比這3 個方面對獼猴桃花粉活力進行分析，以期對提高獼猴桃的結實率和坐果率、促進獼猴桃產業健康發展奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試試驗材料取自武漢市農業科學院林業果樹研究所基地，位于武漢市黃陂區武湖街道。收集開花前1 d 的中華獼猴桃雄花于廣口瓶中，在室內摘掉花瓣，用剪刀剪下花藥，室溫條件下（25～28 ℃）平鋪于紙上（1 d），使其自然陰干。花藥裂開后，過細篩篩出花粉并裝于青霉素瓶中，放于4 ℃冰箱保存。

1.2 花粉制作

本試驗用于測定活力的花粉有兩種，一種是過細篩之后的純花粉，另一種是花粉殼粉碎過篩后將純花粉和花粉殼按照1∶8 的比例混合［7］，現配現用。不同制作方式下的花粉活力用離體萌發法進行測定。

1.3 活力測定

1.3.1 TTC 法 稱取0.5 g TTC（2，3，5-三苯基氯化四氮唑），用少量95%乙醇將其溶解，然后加去離子水定容至100 mL，避光保存。在2 mL 離心管中加入2～3 滴TTC 溶液，用棉棒蘸取少量花粉于離心管中混勻，放入35 ℃恒溫箱中，15 min 后取1 滴溶液至有凹槽的載玻片中，蓋上蓋玻片在低倍顯微鏡下觀察，每個視野選擇100 ?；ǚ塾涗浕ǚ蹱顟B，重復3 次。若花粉被染成紅色，則生活力強，無色的為生活力弱的花粉。

1.3.2 I2-IK 法 I2-IK 溶液依據IK 濃度的不同分為5 個水平，各濃度梯度配比見表1。分別稱取不同質量的IK 和I2，溶解后定容至100 mL，避光保存。在2 mL 離心管中加入2～3 滴I2-IK 溶液，用棉棒蘸取少量花粉于離心管中混勻，室溫下孵育30 min 后取1滴溶液置于有凹槽的載玻片中，蓋上蓋玻片，在低倍顯微鏡下觀察，每個視野選擇100 ?；ǚ塾涗浕ǚ蹱顟B，重復3 次。若花粉被染成藍紫色，則生活力強，黃褐色的為生活力弱的花粉。

表1 IK 的濃度梯度 （單位：g）

1.3.3 離體萌發法 對離體萌發法蔗糖濃度、硼酸濃度和氯化鈣濃度進行了探索，蔗糖濃度為0、5%、10%和20%，硼酸濃度為0、0.05、0.10 和0.20 mg/mL，氯化鈣濃度為0、0.05、0.10 和0.20 mg/mL，共計3 個處理4 個水平，為了使試驗設計達到最優，采用“3414”試驗處理，組合情況見表2。

表2 “3414”試驗各處理組合

按照表2 稱取蔗糖、硼酸和氯化鈣溶于水中，加入0.5%瓊脂，pH 調整為6.5，加熱待瓊脂溶解后在培養皿中倒入薄薄的一層。待培養基凝固后用棉簽蘸取少量花粉灑落在培養基上，蓋上培養皿蓋，在25 ℃恒溫箱中黑暗處理4 h 后，在低倍顯微鏡下觀察花粉萌發情況，當花粉管長度大于花粉粒直徑時認為花粉具有生活力。每個視野選擇100 ?；ǚ塾涗浕ǚ蹱顟B，重復3 次。

2 結果與分析

2.1 不同制作方法對獼猴桃花粉活力的影響

用離體萌發法對花粉活力進行檢測，不同制作方法對獼猴桃花粉活力的影響見表3。在不同培養基中，純花粉萌發率最高為44.6%，混合花粉萌發率最高為77.9%。在大多數培養基中，混合花粉的萌發率比純花粉普遍高20～30 個百分點，最高可達37.7 個百分點（處理6）。

表3 不同制作方法對獼猴桃花粉萌發率的影響（單位：%）

2.2 TTC 染色法測定的花粉活力

TTC 與活細胞內的琥珀酸脫氫酶產生紅色反映，從而判斷細胞的活力。經TTC 染色后的獼猴桃花粉幾乎呈現無色的狀態（圖1A），此方法測定的獼猴桃花粉活力幾乎為0，因此，此方法不能如實反映獼猴桃花粉活力的真實情況。

2.3 I2-IK 染色法測定的花粉活力

活細胞經I2-IK 染色會變成藍色，經I2-IK 染色的獼猴桃花粉呈現黃褐色（圖1B），無論染液濃度的高低，染色效果均無變化，此方法測定的獼猴桃花粉活力和TTC 一樣幾乎為0。因此，I2-IK 染色法同樣不能如實反映獼猴桃花粉的活力。

2.4 離體萌發法測定的花粉活力

離體萌發法測定的獼猴桃花粉活力結果見表4，在暗培養2 h 時有部分花粉管萌發，培養4 h 時萌發基本趨于穩定（圖1C）。由表4 可見，處理6 測定的獼猴桃花粉活力最高，為77.9%，其次為處理7 的69.7%。對混合花粉的萌發結果進行單因素分析和多重比較，除處理7 以外，處理6 的花粉管萌發率與其他處理具有極顯著差異。處理6和處理7的不同在于硼酸濃度不同，處理6 的硼酸濃度為0.1 mg/mL，而處理7的硼酸濃度為0.2 mg/mL。從節省費用、提高測定效果方面考慮，離體萌發法測定獼猴桃花粉活力最佳配比為10%蔗糖+0.1 mg/mL 硼酸+0.1 mg/mL氯化鈣。

表4 離體萌發法各處理獼猴桃花粉萌發率

圖1 不同方法測定獼猴桃花粉活性

3 小結與討論

生產上在進行人工授粉時常用花粉輔料與花粉混合授粉，好處在于提高辨識度，減少花粉用量［8］，同時可以為花粉提供一個穩定的pH 環境保護花粉活性。目前，對花粉輔料相關的研究較少，本研究分別測定了添加輔料與否的花粉活力，結果表明，添加輔料后有助于花粉管的萌發，因此，花粉輔料可能為花粉萌發提供營養，花粉輔料對花粉的作用還需要通過研究來判斷。

花粉活力測定方法較多，TTC 法、I2-IK 法和離體萌發法較為常見。對于野生毛花獼猴桃而言，I2-IK 能有效檢測花粉的活力［9］。通過TTC 法測定的大蕾期花粉活力可達82.3%［3］。本研究結果表明，TTC法和I2-IK 法不適用于本研究供試材料活力的檢測，可能原因是獼猴桃花粉內琥珀酸脫氫酶和淀粉的含量較低，不能被染成相應的顏色。離體萌發法測定的花粉活力為77.9%，因此，離體萌發法更能反映花粉的活性。

“3414”試驗設計吸收了回歸最優設計處理少、效率高的特點［10］，本試驗將“3414”試驗設計應用于獼猴桃花粉活力的測定，大大減少了試驗處理的組合數，效率高、處理少。當蔗糖濃度為10%、硼酸濃度為0.1 mg/mL、氯化鈣濃度為0.1 mg/mL 時，花粉管萌發率最高。在相關研究中，利用離體萌發法測定獼猴桃花粉活力，采用的配方是10%蔗糖和100 mg/L硼酸，這可能與品種、花粉采集時間等不同有關。人工創造的萌發環境和柱頭上的萌發環境存在一定的差異，因此，本研究的結果只能反映花粉活性的大小，最理想的萌發條件還需要進行深入的研究。