3個澳洲堅果MYB蛋白靶基因的克隆與生物信息學分析

李冰，李季東，楊祥燕，蔡元保，李穆，曾黎明，黃思婕

摘 要：【目的】為闡明澳洲堅果MYB（v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）蛋白靶基因的功能及分子作用機制提供了科學的理論依據。【方法】基于澳洲堅果轉錄組數據和RT-PCR方法克隆澳洲堅果MYB蛋白靶基因，并利用生物信息學分析這些基因編碼蛋白質的同源性、系統進化、理化性質、亞細胞定位、跨膜域和信號肽。【結果】獲得了3個新的澳洲堅果MYB蛋白靶基因MiTOM1、MiTOM2和MiTOM3，GenBank登錄號分別為MT319120、MT319121和MT319122。MiTOM1、MiTOM2和MiTOM3都包含典型結構域VHS-ENTH-ANTH，與其它植物來源的TOM蛋白具有極高的序列相似度，與荷花TOM蛋白（XP_010260421.1、XP_010244847.1和XP_010260421.1）的序列相似度分別高達68.93%、75.76%和68.80%。MiTOM1、MiTOM2和MiTOM3蛋白均為親水性蛋白。MiTOM1可能定位于細胞核，為非分泌蛋白和非跨膜蛋白;MiTOM2可能定位于細胞質，為跨膜分泌蛋白;MiTOM3可能定位于細胞核或微體，為非分泌蛋白和非跨膜蛋白。蛋白二級結構預測顯示，MiTOM1、MiTOM2和MiTOM3二級結構主要含有無規則卷曲和α螺旋。【結論】MiTOM1、MiTOM2和MiTOM3包含TOM家族典型結構域VHS-ENTH-ANTH，可能在澳洲堅果體內物質運輸及控制形態發育方面起重要作用。

關鍵詞：澳洲堅果;TOM基因;基因克隆;生物信息學分析

中圖分類號：S664.9? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A

Cloning and Bioinformatics Analysis of Three MYB Protein Target Genes from Macadamia （Macadamia integrifolia）

LI Bing，LI Jidong，YANG Xiangyan，CAI Yuanbao*，

LI Mu，ZENG Liming，HUANG Sijie

（Guangxi Subtropical Crops Research Institute， Guangxi Academy of

Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi 530001， China）

Abstract： 【Objective】This study provides a scientific theoretical basis for elucidating the function and molecular mechanism of macadamia MYB （v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog） protein target genes.【Method】Based on the macadamia transcriptome data， 3 MYB protein target genes of macadamia were cloned by RT-PCR method， and the homology， phylogeny， physicochemical properties， subcellular localization， transmembrane domains， and signal peptides of these genes encoding proteins were analyzed by bioinformatics.【Result】Three new MYB target genes MiTOM1， MiTOM2 and MiTOM3 were cloned. The GenBank accession numbers are MT319120， MT319121 and MT319122 respectively.? MiTOM1， MiTOM2 and MiTOM3 which contain the typical domain VHS-ENTH-ANTH， have high sequence similarity with other plant TOM proteins. The amino acid sequence similarity between MiTOM1 and the lotus TOM proteins （XP_010260421.1， XP_01024847.1， XP_010260421.1） reach 68.93%， 75.76%， and 68.80%， respectively. MiTOM1， MiTOM2 and MiTOM3 are hydrophilic proteins. MiTOM1 which might be located in the nucleus is non-secretory and non-transmembrane proteins; MiTOM2 which might be located in the cytoplasm is transmembrane secretory proteins; MiTOM3 which might be located in the nucleus or microbodies is non-secretory and non-transmembrane proteins. Protein secondary structure prediction shows that MiTOM1， MiTOM2 and MiTOM3 secondary structures mainly contained irregular crimp and α helix. 【Conclusion】MiTOM1， MiTOM2 and MiTOM3 which include TOM family typical domain VHS-ENTH-ANTH， may play an important role in material transportation and morphological development in macadamia.

Key words： Macadamia （Macadamia integrifolia）; TOM genes; gene cloning; bioinformatics analysis

轉錄因子通過識別靶基因上游啟動子區高度保守的特異堿基序列并與之結合，對靶基因的表達進行調控，進而調控植物生長發育、生理代謝以及各種逆境脅迫的應答機制。因此，通過MYB靶基因TOM家族基因的克隆及生物信息學研究，對于闡明澳洲堅果生長發育調控及抗逆分子機制具有重要意義。

植物中轉錄因子的類型多樣，常見的有WAKY類、ERF類、MYB類等，其中MYB類轉錄因子是植物轉錄因子中數量較多的家族之一，按其保守結構域數目的差異可分為R1-MYB、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB和R4-MYB四個家族[1]。MYB轉錄因子功能多樣，在植物生物與非生物脅迫的調節以及植物的整個新陳代謝過程都起著無可代替的作用[2，3，4]。已有的澳洲堅果MYB研究結果表明，MYB家族轉錄因子成員在澳洲堅果生長發育和產量形成過程中起重要作用[5]。但是，有關MYB轉錄因子的靶基因及其調控機制在國內外鮮有報道。TOM1（TOM1-LIKE PROTEIN）是MYB的一個靶標蛋白，與包含VHS（VPS27，Hrs和STAM）結構域的GGA家族密切相關，是第一個被鑒定為具有VHS結構域的蛋白質超家族的成員[6， 7]。已有研究表明，TOM1是內皮素的效應子，并可能在植物體內運輸中起重要作用[8]。Korbe等研究發現擬南芥中MYB靶標蛋白TOL（屬于TOM1類蛋白）作為泛素結合蛋白通過調節生長素的動態分布及其相關生長反應，從而控制植株形態發育，并在降解PM蛋白中起作用[9]。Jeanette等研究結果表明，TOL蛋白在植物中作為多價泛素受體起作用，通過運輸所需的保守內小體分選復合物（ESCRT）途徑控制泛素化的貨物輸送到液泡[10]。整體而言，目前國內外對植物TOM基因的功能研究并不多，其作用的分子機制也不清楚。

澳洲堅果（Macadamia integrifolia）屬山龍眼科澳洲堅果屬植物，是一種原產于澳洲東南部熱帶雨林的常綠果樹，素有“干果之王”的美譽。全球熱帶和亞熱帶約30個國家和地區種植澳洲堅果，我國云南、廣西、貴州、廣東等省區也廣泛種植。澳洲堅果對生長環境條件要求比較高，干旱、冷害等逆境條件會影響澳洲堅果的正常生長發育。由于地形和環境影響，國外優良品種引入我國種植后，受到低溫、干旱、病蟲害等多種生物脅迫和非生物脅迫，澳洲堅果的產量和品質都有所下降[11-14]。通過對澳洲堅果TOM家族基因的克隆和生物信息學分析，闡明TOM基因在澳洲堅果生長發育中的作用，為澳洲堅果抗逆品種選育奠定基礎。但是，目前MYB蛋白靶基因TOM基因在澳洲堅果的相關研究國內外尚未有報道。

本課題組根據澳洲堅果抗寒轉錄組數據，結合RT-PCR方法克隆獲得3個MYB蛋白靶基因，利用生物信息學分析其編碼蛋白的結構與功能，為深入研究澳洲堅果TOM基因在物質運輸及形態發育中的作用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為廣西亞熱帶作物研究所澳洲堅果種質資源圃提供的澳洲堅果光殼種（Macadamia integrifolia）品種Own Choice（O.C.）。對接穗為4個月苗齡的嫁接苗低溫（4 ℃）處理3 h后，采集葉片液氮速凍處理后置于冰箱-80℃保存備用。實驗所用RNA逆轉錄試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、DNA聚合酶、DNA Marker、pMD-18T載體等購自大連寶生物工程有限公司。

1.2 總RNA提取及cDNA合成

參照蔡元保等[15]的CTAB改良法提取澳洲堅果葉片總RNA，利用核酸蛋白檢測儀分析所提取的總RNA純度和濃度，用1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。將抽提好的RNA經DNAaseI進行DNA消化后，取1 ug 總RNA，用RNA逆轉錄試劑盒（TaKaRa，大連）進行反轉錄，合成cDNA第一鏈，將合成好的cDNA置于冰箱-20℃保存。

1.3 澳洲堅果MYB蛋白靶基因克隆

本課題組從澳洲堅果抗寒轉錄組中獲得了3個MYB蛋白靶基因，利用NCBI在線引物設計網站（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）設計這3個基因的CDS克隆引物MiTOM1-F/MiTOM1-R，MiTOM2-F/MiTOM2-R和MiTOM3-F/MiTOM3-R（表1），所用引物全部由大連寶生物工程有限公司合成。

取1.0 μL澳洲堅果葉片的 cDNA 模板進行PCR擴增，PCR擴增總體系25μL，反應體系包括cDNA模板1.0 μL，2×Ex Taq PCR Master Mix 12.0 μL，正向和反向引物（20 mol/L）各1.0 μL，無菌dd H2O 10 μL。反應條件為94℃預變性5 min，94℃變性 45 s，50.2～53.6 ℃（具體見表1）退火 45 s，72℃延伸 1.5 min，擴增35個循環，最后72℃再延伸 7 min。PCR擴增產物經1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測后，采用DNA凝膠回收試劑盒（TaKaRa，大連）進行回收與純化，將其連接到T載體pMD18上，轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞，用含氨芐青霉素抗性的LB固體培養基進行篩選并采用菌落PCR方法挑取陽性克隆，送至上海生工生物工程公司進行序列測序。

1.4 生物信息學分析

利用NCBI網站的BLAST程序進行澳洲堅果MYB蛋白靶基因編碼蛋白質序列和功能結構域的同源檢索，用PROSITE和SMART軟件預測功能結構域，用ProtParam軟件分析目標蛋白質的理化性質，用PSORT軟件分析蛋白質的亞細胞定位，用SignalP 4.1軟件預測蛋白信號肽，用TMpred軟件預測蛋白質的跨膜域，用SOPMA軟件進行蛋白二級結構預測。在NCBI網站GenBank中查找同源蛋白，并用MEGA 7.1軟件鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建同源蛋白的系統發育進化樹。

2 結果與分析

2.1 3個澳洲堅果MYB蛋白靶基因隆與序列分析

以澳洲堅果葉片cDNA為模板，利用特異性引物（表1）擴增3個TOM基因含有開放閱讀框的cDNA片段，凝膠電泳后，分別擴增出了1841 bp、2127 bp和2473 bp的目的條帶（圖1），DNA片段回收后連接到T載體pMD18，經序列測序驗證后，分別命名為MiTOM1、MiTOM2和MiTOM3。序列分析結果顯示，MiTOM1基因開放閱讀框長1542 bp，編碼一個包含513個氨基酸序列的蛋白質，基因登錄號MT319120;MiTOM2基因開放閱讀框長972 bp，編碼一個包含323個氨基酸序列的蛋白質，基因登錄號MT319121;MiTOM3基因開放閱讀框長1407 bp，編碼一個包含426個氨基酸序列的蛋白質，基因登錄號MT319122。

2.2 澳洲堅果MiTOM1、MiTOM2、MiTOM3蛋白理化性質分析

通過ProtParam軟件分析蛋白理化性質表明，MiTOM1編碼氨基酸數量513個，分子質量56.44 kD，理論等電點（PI）5.07，分子式為C2475H3903N685O794S15，帶負電荷殘基（Asp+Glu，天冬氨酸+谷氨酸）71個，帶正電荷殘基（Arg+Lys，精氨酸+賴氨酸）48個，脂肪指數79.61，親水性總平均值（GRAVY，grand average of hydrophilicity）-0.552。

MiTOM2編碼氨基酸數量323個，分子質量36.15 kD，理論等電點6.33，分子式C1600H2602N438O479S16，帶負電荷殘基42個，帶正電荷殘基39個，脂肪指數100.77，親水性總平均值（GRAVY）-0.160。

MiTOM3編碼氨基酸數量468個，分子質量50.96 kD，理論等電點5.12，分子式C2237H3507N613O724S12，帶負電荷殘基59個，帶正電荷殘基43個，脂肪指數73.31，親水性總平均值（GRAVY）-0.547。

2.3 澳洲堅果MiTOM1、MiTOM2、MiTOM3氨基酸序列同源性分析

MYB蛋白靶基因編碼蛋白的同源性檢索分析表明（圖1），澳洲堅果MiTOM1、MiTOM2、MiTOM3蛋白與TOM家族其他成員具有高度的同源性，都具有TOM家族典型的蛋白結構域VHS-ENTH-ANTH。其中，MiTOM1蛋白與荷花（Nelumbo nucifera，XP_010260421.1）、麻風樹（Jatropha curcas，KDP32899.1）、可可（Theobroma cacao，XP_007019272.2）TOM蛋白的氨基酸序列相似度分別為68.93%、64.15%、64.79%;MiTOM2蛋白與荷花（Nelumbo nucifera，XP_010244847.1）、葡萄（Vitis riparia，XP_034690832.1）、酸棗（Ziziphus jujuba，XP_015879670.1）TOM蛋白的序列相似度分別為75.76%、73.38%、73.48%;MiTOM3蛋白與荷花（Nelumbo nucifera，XP_010260421.1）、荷花（Nelumbo nucifera，XP_010270344.1）、赤豆（Vigna angularis，XP_017421990.1）TOM蛋白的序列相似度分別為68.8%、67.17%、65.72%。

2.4 澳洲堅果MiTOM1、MiTOM2、MiTOM3系統進化樹分析

利用MAGE 7.1軟件構建植物TOM蛋白的系統發育進化樹。結果顯示（圖3），20個TOM蛋白可明顯分成2組，其中MiTOM1與MiTOM3處于同一組，與荷花TOM蛋白（XP_0120260421.1，XP_010270344.1）的親緣關系最近;MiTOM2處于另一組，與荷花TOM蛋白（XP_010244847.1）和相思子TOM蛋白（XP_027340603.1）的親緣關系最近。

2.5 澳洲堅果MiTOM1、MiTOM2、MiTOM3蛋白疏水性分析

通過ExPASy服務器中的ProtScale程序分析澳洲堅果MiTOM1、MiTOM2和MiTOM3蛋白的疏水性。結果顯示，MiTOM1（圖4A）、MiTOM2（圖4B）和MiTOM3（圖4C）的疏水性最大值與親水性最小值之和都為負值，因此推斷這3個蛋白均為親水性蛋白。與上述的這3個蛋白理化性質分析結果一致，即這3個蛋白的親水性總平均值（GRAVY）均為負值，推測為親水性蛋白。

2.6 澳洲堅果MiTOM1、MiTOM2、MiTOM3蛋白功能預測

PSORT軟件預測表明，MiTOM1蛋白可能定位于細胞核（概率為30%），MiTOM2蛋白可能定位于細胞質（概率為65%），MiTOM3蛋白可能定位于細胞核和微體（概率均為30%）。利用SignalP和TMpred軟件分析蛋白的跨膜結構和信號肽。結果顯示，MiTOM1蛋白不存在信號肽和跨膜結構，為非分泌蛋白;MiTOM2蛋白存在2個跨膜結構，為分泌蛋白;MiTOM3蛋白不存在信號肽和跨膜結構，為非分泌蛋白。

2.7 澳洲堅果MiTOM1、MiTOM2、MiTOM3蛋白的二級結構分析

SOPMA軟件的二級結構分析結果顯示，MiTOM1蛋白二級結構的主要元件是無規則卷曲（Random coil）（54.88%）、α-螺旋（Alpha helix）（36.26%）、折疊延伸鏈（Extended strand）（4.87%）和β轉角（Beta turn）（4.29%）（圖5A）;MiTOM2蛋白二級結構的主要元件是無規則卷曲（35.29%）、α-螺旋（52.63%）、折疊延伸鏈（7.43%）和β轉角（4.64%）（圖5B）;MiTOM3蛋白二級結構的主要元件是無規則卷曲（56.84%）、α-螺旋（36.32%）、折疊延伸鏈（4.49%）和β轉角（2.35%）（圖5C）。可見，這3個蛋白的VHS-ENTH-ANTH結構域主要由α-螺旋組成。

3 討論

轉錄因子靶基因的預測與驗證是功能基因組研究的一種重要方法。不但可為基因功能解析提供參考，也可了解基因的表達調節機理，并進一步構建基因表達的調控網絡。MYB轉錄因子參與植物生長發育、生理代謝以及各種逆境脅迫的應答機制[2，3，4]。TOM是MYB蛋白的一個靶基因，其編碼蛋白包含TOM家族典型結構域VHS-ENTH-ANTH[6， 7]。

澳洲堅果MiTOM1、MiTOM2和MiTOM3與其它TOM家族成員的氨基酸序列具有高度相似性，且都含有結構域VHS-ENTH-ANTH。可見，澳洲堅果MiTOM1、MiTOM2和MiTOM3屬于TOM家族，即同樣作為MYB靶標蛋白。系統發育進化樹分析顯示，這3個澳洲堅果TOM蛋白分別屬于2個不同的進化分支。進化關系接近且處于同一進化分支的成員可能具有類似的空間結構和生物學功能[16，17]，這為進一步研究3個澳洲堅果TOM蛋白的功能特征奠定基礎。

澳洲堅果MiTOM1和MiTOM3可能定位于細胞核或微體，不存在信號肽和跨膜結構，推測這2個蛋白作為非分泌親水蛋白行駛其生物學功能。澳洲堅果MiTOM2蛋白可能定位于細胞質，存在2個跨膜結構，作為分泌親水蛋白在翻譯后進行蛋白加工和剪切。這3個澳洲堅果TOM蛋白二級結構的主要元件是無規卷曲和α-螺旋，并夾雜著折疊延伸鏈，且這些結構相對保守。而且，這3個TOM蛋白VHS-ENTH-ANTH結構域的主要組成是α-螺旋。這說明在長期的進化過程中，澳洲堅果MiTOM1、MiTOM2和MiTOM3蛋白的空間結構相對保守，推測其有類似的生物學功能。

已有研究表明，作為MYB蛋白的靶基因TOM1和TOL能夠調節植物體內運輸，調節生長素的動態分布及其相關生長反應，從而控制植株形態發育[8-10]。同屬于TOM家族的澳洲堅果MiTOM1、MiTOM2和MiTOM3，與這些MYB靶標蛋白具有高度的序列相似性和進化同源性。因此，推測澳洲堅果MYB轉錄因子通過識別這3個靶基因上游啟動子區高度保守的特異堿基序列并與之結合，對這些靶基因的表達進行調控，進而在澳洲堅果體內物質運輸及控制形態發育方面起重要作用。至于這3個澳洲堅果TOM基因在調控其生長發育及抗逆分子機制方面還有待于深入研究。

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