油菜菌核病拮抗內生菌的篩選及其生防效果研究

陳 嫻，李詠梅，曾 艷，伍善東，劉冬華

（湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009）

油菜是我國重要的油料作物，是湖南省僅次于水稻生產面積的第二大農作物，種植面積和菜籽產量均位居全國前列[1-2]。油菜的生長周期較長，病害種類較多，有菌核病、病毒病、白銹病、黑斑病等[3-4]。其中，危害最嚴重的是油菜菌核病，該病在我國各油菜產區均有發生。油菜菌核病是由核盤菌感染引發的一類土傳病害，其危害導致的減產量約占總病害減產量的80%，嚴重影響油菜產量和品質[5]。長期以來，油菜菌核病的防治主要是噴施化學殺菌劑，如苯并咪唑類殺菌劑。隨著藥劑的常年使用，殘留的藥劑會對環境產生污染；同時，部分核盤菌對這類化學藥劑產生了明顯的抗藥性，從而導致藥劑的防治效果越來越差[6-7]。隨著人們對生態環保、食品安全的重視，利用生物法防治農作物病蟲害已成為目前人們關注的熱點。

植物內生菌是一類能夠定殖在健康植物組織內部而對宿主植物不造成明顯病害癥狀的一類微生物。內生菌從植物體獲取生存空間、營養的同時，也會給植物帶來一些生長上的優勢，如促進植物生長、提高植物抗病能力等[8]。隨著綠色農業的興起，我國科學界對植物內生菌的研究和應用逐漸增加[9]。已有研究表明，枯草芽孢桿菌BY-2[10]、多粘類芽孢桿菌SF4[11]、芽孢桿菌Y171004、Y177002[12]等油菜內生菌對核盤菌有抑制效果。根據文獻檢索，目前可用來防治油菜菌核病的內生拮抗菌種類仍然較少，且未見有進入田間實際應用的微生物菌劑的報道。為了尋求效果優良的油菜菌核病生防菌株，研究從油菜植株中分離得到1 株高效的拮抗菌1-4，并進行了菌種鑒定，初步探討了該菌對菌核病的防治效果，豐富了油菜菌核病內生拮抗菌菌種資源，為進一步開展田間試驗提供了基礎和依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株油菜內生菌：由實驗室從健壯油菜根、莖的韌皮部分離得到。核盤菌ACCC 37701（源自油菜）由中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所提供。

1.1.2 培養基（1）PDA 加富培養基：土豆（煮汁）200 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨2.0 g/L，牛肉膏2.0 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，瓊脂18 g/L，自然pH 值。（2）牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，pH 值 7.0。加入18 g/L的瓊脂即為固體培養基。

1.2 試驗設計

1.2.1 油菜內生菌的分離純化采集健壯的油菜植株，用清水將根部泥沙洗干凈，削取白色健壯無斑的根須和韌皮部。用75%的酒精浸泡消毒12 min，無菌水浸泡洗滌6 次；再用0.2%的HgCl2浸泡消毒18 min，無菌水浸泡洗滌9 次，第9 次的浸泡洗滌水留下作為對照。將油菜根須和韌皮部放入無菌碾缽中加入適量無菌水碾磨成漿，取漿液進行梯度稀釋（10-1～10-5）。從各稀釋梯度液中吸取200 μL 涂布到PDA 加富培養基平板上，28℃恒溫培養5 d 后，挑取不同形態的單個內生菌落，在平板上采取四分區劃線法純化3～4 次，將純化后單菌落利用試管斜面低溫保存待用。

1.2.2 核盤病菌拮抗菌株的篩選（1）平板對峙法初篩：將直徑為1 cm 的油菜核盤菌接種到PDA 加富平板（直徑9 cm）的中心，將所有分離的內生菌接種到距離平板中心2.5 cm 處，以不接種內生菌的平板為對照，28℃恒溫培養，每個處理重復3 次。待對照組核盤菌長滿平板時，測量各內生菌產生的抑菌圈直徑，選出具有拮抗效果的內生菌進行復篩。（2）牛津杯法復篩：將直徑為1 cm 的油菜核盤菌接種到PDA 加富平板（直徑9 cm）的中心，在距核盤菌菌絲擴展的外緣呈等邊三角形放置3 個牛津杯，再將培養5 d 的拮抗菌菌液加入至牛津杯中，每處理重復3 次。將平板置于28℃恒溫培養3 d，觀察抑菌圈并用游標卡尺測量記錄其直徑。

1.2.3 拮抗菌1-4的菌種鑒定（1）形態學觀察、生理生化鑒定：將效果最佳的拮抗菌1-4 接種在牛肉膏蛋白胨平板上，培養3 d 后觀察其菌落形態特征和顯微形態特征。參照《常見細菌系統鑒定手冊》中操作說明，對拮抗細菌1-4 進行生理生化鑒定。（2）16S rDNA 序列分析：用細菌基因組DNA 提取試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）提取菌株1-4的基因組DNA，采用通用引物27F（5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′）、1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3′）進行16S rDNA 序列的擴增。PCR 反應條件：95℃預變性4 min；95℃ 45 s，56℃ 45 s，72℃ 90 s，30 個循環；72℃延伸10 min，4℃終止。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，采用膠回收試劑盒純化回收，送上海生物工程有限公司測序。測序結果在NCBI 數據庫中進行Blast 比對，利用Mega 5.0 軟件中Neighbor-joining 方法構建系統發育進化樹。

1.2.4 拮抗菌1-4對油菜菌核病的盆栽防治效果接種拮抗菌1-4 到牛肉膏蛋白胨液體培養基發酵培養72 h，稀釋發酵液活菌數至1.0×108CFU/mL 制成菌懸液，待用。將菌懸液以4℃，8 000 r/min 離心15 min，取上清液并用0.22 μm 的細菌過濾器過濾，制成無菌發酵液待用。該試驗所用油菜品種為甘藍型油菜湘油15，在每個小號培養盆中種植一株，待油菜長至5～8片葉時，分別將菌株1-4 的菌懸液和無菌發酵液均勻噴施于葉片表面，30 min 后接種直徑5 mm 的油菜菌核病菌菌絲塊，置于25℃左右人工氣候箱中保濕培養（光照/黑暗=16 h/8 h），以噴施無菌牛肉膏蛋白胨液體培養基處理的葉片為對照。每個處理重復5 株，2 片葉/株，1 個菌絲塊/片葉，重復3 批次。當對照葉片上出現病斑時以及出現病斑2 d 后分別統計發病情況。記錄各處理發病植株數及發病嚴重度，根據公式（1）和（2）計算病情指數和防治效果。病害嚴重度分級標準：0 級表示無病；1 級表示病斑面積占全葉10%以下；2 級表示病斑面積占全葉10%～30%；3級表示病斑面積占全葉31%～50%；4 級表示病斑面積占全葉51%以上[13]。

1.3 數據分析

采用Excel 2003 軟件計算試驗數據的平均值和標準差，并進行繪圖；利用SPSS 18.0 軟件進行單因素方差（ANOVA）統計分析，采用Duncan 法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 油菜菌核病內生拮抗菌的篩選

根據菌落形態、顏色、邊緣等特征對油菜內生菌比較去冗余后，利用PDA 加富培養基共分離出72 株內生菌。用平板對峙法進行初篩后，發現有6 株菌株對核盤菌有抑制作用。牛津杯法復篩結果（圖1）表明，菌株1-4、7-3 抑菌圈直徑較大，其中菌株1-4 對油菜核盤菌的抑制能力最強。采用連續傳代法對菌株的遺傳穩定性進行檢測，結果如圖2 所示，菌株1-4 發酵液的抑菌活性在傳代過程中無顯著改變，說明其遺傳穩定性好。因此，選擇該菌株進行下一步研究。

圖1 篩選出的拮抗內生菌對核盤菌的抑菌效果

圖2 菌株1-4 抑菌能力的遺傳穩定性

2.2 菌株1-4 的菌種鑒定

菌株1-4 在牛肉膏蛋白胨平板上形成的菌落呈圓形，表面粗糙，邊緣不整齊，無色素產生；在油鏡下，菌體為中等長度桿狀，單生，產芽孢（圖3），革蘭氏染色呈陽性。菌株的生理生化試驗結果如表1 所示，這些生理生化特性與《伯杰氏細菌鑒定手冊》中對地衣芽孢桿菌的描述一致。

圖3 菌株1-4 的菌落形態及顯微形態特征（×1 000 倍）

表1 菌株1-4 的生理生化試驗結果

PCR 擴增獲得菌株1-4 的 16S rDNA 序列長度為 1 430 bp（Genbank 登錄號：MZ520363），將其與NCBI 數據庫中已有序列進行BLAST 比對，菌株與Bacillus licheniformisDSM 13 的相似性較高，基于其16S rDNA 序列構建的系統發育樹如圖4 所示。結合菌株形態學特征、生理生化特征和系統進化樹分析的結果，可確定菌株1-4 為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。

圖4 基于菌株16S rDNA 序列構建的系統發育樹

2.3 菌株1-4 對油菜菌核病的盆栽防治效果

盆栽試驗結果（表2）顯示，試驗48 h 時，菌株1-4 的菌懸液和無菌發酵液處理組的油菜菌核病病情指數均顯著低于對照組，防治效果分別為84.84%、76.07%，說明菌懸液和無菌發酵液處理對油菜菌核病均有顯著抑制效果。試驗96 h 時，各處理組油菜的病情指數不斷增大，菌懸液、無菌發酵液處理的防治效果分別為78.22%、69.95%，比之前有所降低，但仍具有較好的防治效果。試驗結果還顯示，菌懸液處理的防治效果顯著高于同時期無菌發酵液處理，說明活菌體才是防治效果發揮的根本原因。

表2 菌株1-4 對油菜菌核病的盆栽防治效果

3 結 論

該研究從健壯油菜植株內分離得到72 株內生菌，通過平板對峙法和牛津杯法篩選到6 株對油菜菌核病致病菌核盤菌具有拮抗活性的內生菌。其中，菌株1-4對核盤菌的抑制作用非常顯著，且經過連續傳代培養后，其抑菌特性能夠穩定遺傳。結合形態學特征、生理生化特性及16S rDNA 序列分析，將菌株1-4 鑒定為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。盆栽試驗結果表明，該菌株的菌懸液和無菌發酵液均對油菜菌核病有較好的防治效果，且菌懸液處理的防效優于無菌發酵液。

4 討 論

目前，科技工作者主要從農作物根際土壤微生物和作物內生菌中篩選病蟲害生防菌。相對于根際土壤微生物，作物內生菌是一類與植物互惠共生的微生物，可以提高作物對生物脅迫和非生物脅迫的抵抗能力，生物安全性高。地衣芽孢桿菌是一種廣泛應用的生防菌，對稻瘟病菌、輪紋病菌、青霉病菌、枯萎病菌等具有一定的防效。據統計（截至2020 年9 月），地衣芽孢桿菌在7 051 種登記的微生物菌肥產品中的應用頻次為1 517 次，應用率為21.51%，應用非常廣泛[14]。該類生防菌的安全性高、生長快、抗逆能力強，故該試驗篩選獲得的拮抗菌1-4 具有良好的應用前景。

拮抗菌1-4 的無菌發酵液對油菜菌核病也有顯著的防治效果，說明其在發酵過程中產生了某些抑制核盤菌生長的物質。孫啟利等[15]研究發現，地衣芽孢桿菌W10 產生的抗菌蛋白可顯著抑制病菌的生長，而菌株1-4 是否也可產生類似的抗菌蛋白，有待進一步研究。該試驗中，菌懸液處理的防治效果顯著優于同時期無菌發酵液處理，其原因可能是菌懸液中的活菌體能夠在油菜上定殖，循環產生拮抗物質[10]。