浸潤性肺腺癌組織學亞型與驅動基因狀態的相關性研究〔1〕

周兵，王潔，彭麗姿，張劍鋒

(1.九江市第一人民醫院，江西 九江 332000；2.江西省腫瘤醫院，江西 南昌 330029)

近年來，隨著分子生物學研究的深入和基因測序工作的廣泛開展，腫瘤治療邁入到精準醫學時代，研究證實可以通過調節腫瘤的血管內皮生長因子和干擾細胞信號轉導通路來抑制腫瘤的發生[1]。針對性的肺腺癌驅動基因突變靶點的藥物治療，相對于傳統化療藥物，不僅具有作用精準、效用好等優勢，而且細胞毒性小、不良反應小，能夠使晚期肺腺癌患者獲益，極大地延長了患者的生存時間，改善了預后[2]。因此，肺腺癌各驅動基因的精準檢測對于臨床治療的指導作用就顯得尤為重要。而肺腺癌的組織學分型不僅被認為能夠更好地體現腫瘤的生物學行為，同時與腫瘤的發生、組織侵犯和預后評估存在直接聯系，部分國外學者認為與分子學改變存在一定聯系[3]。本研究依據肺腺癌的國際多學科分類標準(IASLC/ATS/ERS)對收集肺腺癌病例進行分類，同時利用二代測序(NGS)法檢測常見驅動基因的狀態，結合患者臨床特征，探討浸潤性肺腺癌組織學亞型與驅動基因狀態的相關性。

1 材料與方法

1.1 臨床標本

回顧性收集2017年9月—2020年8月九江市第一人民醫院確診為浸潤性肺腺癌的手術標本87 例，男53 例，女34 例；年齡32～85 歲，中位年齡61 歲，其中<60 歲38 例，≥60 歲49 例；有吸煙史31 例，淋巴結轉移28 例；2018年國際抗癌聯盟(UICC)分期Ⅰ～Ⅱ期57 例，Ⅲ～Ⅳ期30 例。

1.2 組織學形態

所有收集的肺腺癌組織學標本經4%中性甲醛隔夜固定后，常規取材、脫水、石蠟包埋、切片并蘇木精-伊紅(HE)染色。兩名高年資組織病理醫師采用雙盲法依據IASLC/ATS/ERS評價標準對組織學進行分類，同時結合各組織學亞型在標本中所占比例分為腺泡為主型、貼壁生長為主型、微乳頭為主型、乳頭為主型和黏液實體為主型的亞型。

1.3 驅動基因狀態

采用石蠟組織樣本基因抽提試劑盒(德國Qiagen公司)對浸潤性肺腺癌石蠟標本按操作說明書進行DNA提取，紫外分光光度計檢測DNA樣本濃度及吸光度(OD)值，確保濃度≥10 ng/μL，OD值為1.8～2.0。使用文庫制備試劑盒(美國Illumina公司)構建DNA測序文庫，采用人多基因突變檢測試劑盒[表皮生長因子受體(EGFR)、鼠類肉瘤病毒癌基因(KRAS)、間變性淋巴瘤激酶(ALK)、肝細胞生長因子(c-MET)、鼠類肉瘤病毒癌基因同源物基因(BRAF)、酪氨酸激酶受體2(ERBB2)、肉瘤致癌因子-受體酪氨酸激酶(ROS1)、RET原癌基因(RET)]和基因突變捕獲探針上高通量測序平臺(美國Illumina公司)進行測序，將所得到的數據進行過濾并生物信息學分析。

1.4 統計學方法

使用SPSS20.0軟件對所得數據進行統計學分析。采用χ2檢驗及Fisher精確概率法對各基因與臨床特征資料及組織學亞型的相關性進行比較。α=0.05為檢驗水準，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 組織形態學亞型

87 例浸潤性腺癌經HE染色后，腺泡為主型的亞型共45 例，占所有病例的51.7%，鏡下腫瘤呈腺管狀、篩孔狀排列，細胞立方柱狀向腔內生長(見圖1A)；貼壁生長為主型的亞型8 例(9.2%)，腫瘤異型稍小，細胞沿肺泡壁呈釘突狀生長(見圖1B)；乳頭為主型的亞型13 例(14.9%)，腫瘤呈2～3 級乳頭狀，以纖維血管為軸心；微乳頭為主型的亞型7 例(8.1%)，腫瘤呈簇狀、微乳頭狀，未見明顯的纖維血管軸心，伴腔內脫落多量微乳頭狀結構(見圖1C)；黏液實體為主型14 例(16.1%)，腫瘤呈實性片狀生長，伴部分細胞富含豐富的黏液成分(見圖1D)。最多的腺泡為主的亞型與較少的貼壁生長和微乳頭狀為主型的亞型比較，差異有統計學意義(χ2=19.645，P<0.001)。

A：腺泡為主型(HE×100)；B：貼壁生長為主型(HE×100)；C：微乳頭狀型(HE×100)；D：黏液實體型(HE×100)

2.2 臨床特征與驅動基因狀態的關系

在87 例肺浸潤腺癌8 種常見的驅動基因檢測中，檢出7 種驅動基因共計68 例突變，其中單基因突變66 例，雙基因共存突變2 例(EGFR+c-MET和KRAS+BRAF)，總突變率為78.2%。EGFR共突變42 例(48.3%)(見圖2A)，其中女性突變率為64.7%，明顯高于男性的37.7%(P=0.014)；無吸煙史患者突變率為57.1%，明顯高于有吸煙史患者的32.3%(P=0.026)；臨床分期Ⅲ～Ⅳ患者突變率為63.3%，明顯高于Ⅰ～Ⅱ期患者的40.4%(P=0.041)，但與年齡和淋巴結轉移關系不大(P>0.05)(見表1)。KRAS共突變10 例 (11.5%)(見圖2B)，其中有吸煙史患者突變率為22.6%，明顯高于無吸煙史患者的5.4%(P=0.039)，但與性別、年齡、淋巴結轉移和臨床分期關系不大(P>0.05)。ALK共突變8 例(9.2%)(見圖2C)，其中女性突變率為17.6%，明顯高于男性的3.8%(P=0.029)；<60 歲患者突變率為18.4%，明顯高于≥60 歲患者的2.1%(P=0.024)，但與吸煙史、淋巴結轉移和臨床分期關系不大(P>0.05)。c-MET共突變5 例(5.7%)，其中女性和淋巴結轉移各突變4 例。BRAF突變 2 例(見圖2D)，EBER2和ROS1各突變1 例，但由于以上基因突變率低，暫未發現其與臨床特征的相關性。

表1 基因突變與臨床特征的關系

A：EGFR-L858R突變；B：KRAS-G12D突變；C：EML4-ALK融合；D：BRAF-V600突變

2.3 組織學亞型與驅動基因狀態的關系

42 例EGFR突變病例中，腺泡為主型的亞型突變率為44.4%(20/45)，與其他類型比較，差異無統計學意義(χ2=0.548，P=0.459)；而其中貼壁生長為主型和微乳頭狀為主型突變率較高，分別為75.0%(6/8)和85.7%(6/7)，黏液實體為主型突變率明顯較低，僅為14.3%(2/14)；貼壁生長及微乳頭狀為主型與其他類型EGFR突變具有相關性(χ2=7.305，P=0.007)。10 例KRAS突變病例中，腺泡為主型突變率為11.1%(5/45)，與其他類型比較，差異無統計學意義(χ2=0.049，P=0.826)；其中突變率最高的是乳頭狀為主型的亞型15.4%(2/13)，最低的為黏液實體為主型的亞型7.1%(1/14)，各組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。8 例ALK突變病例中，腺泡為主型的亞型突變率為4.4%(2/45)，與其他類型比較，差異無統計學意義(χ2=1.479，P=0.224)；其中黏液實體為主型的亞型突變率最高，為28.6%(4/14)，與其他類型比較，差異有統計學意義(χ2=4.991，P=0.026)。5 例c-MET突變病例中，腺泡為主型的亞型突變率為6.7%(3/45)，與其他類型比較，差異無統計學意義(χ2=0.006，P=0.937)；其中微乳頭為主型的亞型突變率最高，為28.6%(2/7)，與其他類型比較，差異有統計學意義(Fisher精確概率，P=0.042)。BRAF在腺泡為主型及黏液實體為主型各突變1 例，ERBB2和ROS1基因突變1 例均發生在腺泡為主型病例，由于納入研究病例較少，暫未發現其間的統計學差異(見表2)。

表2 組織學亞型和基因突變的相關性 例(%)

3 討 論

肺腺癌的精準靶向治療是現代醫學取得的一項重大進步，不僅豐富了常規的腫瘤治療手段，而且延長了患者的生存時間，改善了生存質量[4]。精準的治療需要精準的基因檢測手段，二代測序技術作為一類新興的檢測技術，具有高通量、低成本、靈敏度高等特點，已經廣泛應用于肺癌的多基因檢測中[5]。2020年美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)指南推薦對所有能夠獲得的肺癌組織學標本，應常規檢測靶向基因EGFR，ALK，ROS1，BRAF，KRAS突變，針對新出現的靶向基因c-MET，RET，HRBB2也建議聯合檢測[6]。最近IASLC/ATS/ERS多學科分類對肺腺癌組織學分類做了重新修訂，廢除了“細支氣管肺泡癌”陳舊概念，同時引入了“原位腺癌”新的定義，在此基礎上引申是否具有微浸潤性；同時不再使用混合亞型這一既往主要的浸潤性腺癌分類，而單獨界定各自分型中的腺泡型、乳頭型以及黏液實體分泌型、貼壁生長型及微乳頭型。在所有分型中貼壁生長型預后最好，5年無復發生存率達90%以上，而微乳頭亞型預后最差，5 年無復發生存率不足20%。因此，肺浸潤性腺癌形態學變化的區分不僅能判定腫瘤的侵襲性，同時對預后評估極為重要[7]。近年來，有國外學者[8]在研究肺非小細胞癌的驅動基因狀態時偶然發現，各基因的突變狀態與組織學亞型間存在一定的聯系，能夠通過組織學亞型來預測基因突變的發生。

本研究對收集的浸潤性肺腺癌87 例標本進行組織學亞型分類，腺泡為主亞型，占所有病例的51.7%，與較為少見的貼壁生長為主型和微乳頭狀為主型比較，差異有統計學意義，這與關于形態學的研究類似[9]，證實腺泡為主型依然是最常見的組織學亞型。利用NGS技術對87 例組織學標本行常規的8 種靶向基因檢測，共檢出7 種驅動基因共計68 例突變，總突變率78.2%。各突變基因在與臨床病理學相關性中，EGFR突變與女性、無吸煙史和臨床分期Ⅲ～Ⅳ期存在相關性，證實其在不吸煙的女性晚期肺腺癌患者中突變率更高，這與Song等[10]收集的肺腺癌大樣本研究EGFR與臨床病理間得出的結論一致，但與Wang等[11]研究認為的EGFR突變與臨床分期并無明顯相關存在較大差異，這可能與各研究納入的標本異質性或含量差異有關。KRAS突變與吸煙史存在相關性，與Wang等[12]報道一致，表明其在吸煙患者中突變率較高。ALK融合基因與女性、<60 歲患者存在相關性，其基因學改變可能在年輕女性患者中突變率較高，Koh等[13]的研究也得出同樣的結論。c-MET突變率較低，國內學者朱衛東等[14]發現c-MET與女性患者存在相關性，本研究5 例中女性和淋巴結轉移各突變4 例，說明有可能與上述兩個因素存在一定關系，有待進一步擴大樣本量研究。ERBB2和ROS1各突變1 例，暫未發現其與臨床病理特征的相關性。EGFR突變中，微乳頭狀為主型突變率最高，為85.7%，黏液實體為主型突變率最低，僅14.3%，這些與Russell等[15]研究結果類似。相對于腺泡為主型、乳頭狀為主型和黏液實體為主型，EGFR突變與貼壁生長為主型和微乳頭狀為主型具有明顯的相關性。Wang等[12]通過研究肺腺癌細胞學形態和分子學改變發現，相對于其他類型，微乳頭類型的EGFR突變率更高，與本研究結果一致。KRAS突變在各形態學亞型中均有分布，尚未發現之間的相關性，同時既往研究文獻也未見相關性報道[13]。ALK突變與黏液實體為主型具有相關性，雖然與Doebele等[16]認為的ALK基因突變主要見于腺泡型和黏液實體為主型結果有一定出入，但與Jin等[17]的研究結果一致，認為黏液實體為主型更易于發生ALK基因重排。雖然c-MET突變率較低，但有趣的是本研究發現其在微乳頭亞型中更占優勢。由于該基因納入樣本及突變均數量較少，還存在一定的爭議，有望再擴大標本量進一步論證。BRAF，ERBB2，ROS1和RET突變率過低，尚未發現其與組織學亞型間的相關性。

綜上所述，浸潤性肺腺癌EGFR突變更常見于女性、不吸煙和臨床分期Ⅲ～Ⅳ期為主型的患者，在貼壁生長和微乳頭狀亞型中突變率更高。KRAS突變在吸煙患者中多見，但與組織學亞型關系不大。ALK突變與女性、年齡<60 歲患者及黏液實體為主型的亞型相關。而c-MET與女性患者及微乳頭狀組織學亞型關系密切。但對于BRAF，ERBB2，ROS1和RET基因突變與組織學亞型間的相關性尚不明確，因此，揭示更多驅動基因狀態與組織學亞型間的相關性，將是我們今后的重點研究方向。