固相萃取/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定獸藥制劑中非法添加8 種硝基咪唑類藥物

張海超，賈海濤，張婧雯，王 敬，艾連峰*，霍惠玲，李研東

（1.石家莊海關技術(shù)中心，河北 石家莊 050011；2.河北省獸藥監(jiān)察所，河北 石家莊 050050）

硝基咪唑類藥物是一類廣泛應用的人工合成藥物，具有5-硝基咪唑基本結(jié)構(gòu)，對原蟲以及各種厭氧細菌具有顯著的抑制作用，能促進牛、豬、禽的生長及改善飼料轉(zhuǎn)化率。用于獸藥的硝基咪唑類藥物主要包括地美硝唑、異丙硝唑、甲硝唑、塞克硝唑、羅硝唑、奧硝唑、卡硝唑和替硝唑等[1]。但是，由于硝基咪唑類藥物具有細胞誘變性，有潛在的動物致畸、致癌性和致突變作用，其殘留對動物源性食品安全構(gòu)成直接威脅。因此，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號中將羅硝唑和替硝唑列為食品動物禁止使用的藥品[2]。目前，關于獸藥中非法添加硝基咪唑類藥物的標準有《農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第289號獸藥中非法添加硝基咪唑類藥物檢查方法》，采用液相色譜法測定羅硝唑、甲硝唑、替硝唑、地美硝唑、奧硝唑和異丙硝唑含量，檢測限為1 mg/g[3]，但此方法存在靈敏度低、抗干擾能力差等缺點。馬東杰等[4]采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定中獸藥制劑中甲硝唑、地美硝唑、異丙硝唑和羅硝唑的含量，檢出限為10 μg/kg，雖然靈敏度高，但測定化合物數(shù)量有限，故該方法仍存在一定局限性。其他關于硝基咪唑藥物檢測文獻中的測定方法多為飼料[5-7]和動物源性食品[8-10]基質(zhì)，關于適用獸藥制劑基質(zhì)的測定方法較少。因此，建立一種可靠的測定獸藥制劑中非法添加硝基咪唑類藥物方法對獸藥行業(yè)發(fā)展具有重要意義。文章選取4種獸藥制劑為代表性基質(zhì)樣品，對提取溶劑、凈化方式及色譜條件進行研究，采用SCX柱凈化，建立獸藥制劑中硝基咪唑類藥物的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法。該方法操作簡單、凈化效果好，可為測定獸藥制劑中非法添加硝基咪唑類藥物提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

8050 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（SHIMADZU 公司）、KQ-500E 超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）、Sigma 3K-15 型離心機（Sigma 公司）、PT2100 型均質(zhì)器（KINEMATICA 公司）、渦旋混合器（Scientific Industries）、Milli-Q純水系統(tǒng)（Millipore公司）。

色譜純乙腈、甲醇、丙酮、氨水，購自飛世爾試劑公司；分析純氯化鈉購自國藥集團化學試劑有限公司；試驗所用純水均由美國Milli-Q純水系統(tǒng)制得。

標準品：地美硝唑、異丙硝唑、甲硝唑、塞克硝唑、羅硝唑、奧硝唑、卡硝唑、替硝唑，純度大于97%。混合型陽離子（SCX）固相萃取柱（150 mg/6 mL，Agela公司）。

1.2 混合標準溶液的配制

分別稱取8種硝基咪唑類藥物標準品10.0 mg（折合純度后）于10 mL 棕色容量瓶中，使用甲醇溶解，定容，得到濃度為1 g/L的單標儲備液，于4 ℃下避光保存。準確移取適量硝基咪唑標準儲備液，使用甲醇稀釋成混合標準工作液，待用。

1.3 樣品前處理

固體樣品：稱取2 g樣品（精確至0.01 g）于50 mL塑料離心管中，加入20 mL乙腈溶液，混勻，均質(zhì)器10 000 r/min均質(zhì)1 min。

液體樣品：稱取2 g樣品（精確至0.01 g）于50 mL塑料離心管中，加入20 mL 乙腈溶液和4 g 氯化鈉，混勻，均質(zhì)器10 000 r/min均質(zhì)1 min。將各樣品提取液以4 000 r/min離心5 min，取上清液待凈化。

SCX固相萃取柱依次用甲醇、乙腈各取5 mL活化，將5 mL 上清液過柱，依次用5 mL 丙酮、5 mL 甲醇淋洗，壓干。使用6 mL 5%氨水甲醇洗脫，40 ℃下氮氣吹干，準確加入50%甲醇溶液溶解殘渣混合均勻，過0.22 μm濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進行測定。

1.4 分析條件

色譜柱為Waters BEH C18柱（100 mm× 2.1 mm，1.7 μm）；柱溫為35 ℃，進樣量1 μL；流動相：A 為0.1%甲酸水，B 為乙腈；流速為0.3 mL/min。梯度洗脫程序：0～0.5 min，5% B；0.5～4.0 min，5%～90% B；4.0～6.0 min，90%B；6.0～6.1 min，90%～5%B；6.1～8.0 min，5%B。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離源ESI，采用多反應監(jiān)測（MRM）正離子掃描模式。離子源溫度為300 ℃，毛細管溫度為250 ℃，加熱模塊溫度為400 ℃，氮氣流速3.0 L/min，干燥氣流速10.0 L/min，加熱氣流速10.0 L/min，其他參數(shù)見表1。

表1 8種硝基咪唑類藥物的質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters of eight nitroimidazole

2 結(jié)果與分析

2.1 獸藥制劑種類的選擇

魚腥草注射液主要成分為魚腥草，主要作用為清熱解毒、消腫排膿、利尿通淋。硫酸新霉素可溶性粉主要用于治療禽敏感革蘭氏陰性菌所致的胃腸道感染。荊防解毒散主要成分為荊芥、防風、羌活、獨活、柴胡等，主要功能是辛溫解表，疏風祛濕。白頭翁口服液主要成分是白頭翁、黃連、秦皮、黃檗，主要功能是清熱解毒、涼血止痢。硝基咪唑類藥物因其類似功能極有可能加入上述獸藥中。因此，本試驗選用上述4種獸藥分別作為針劑、粉劑和酊劑的代表性樣品。

2.2 提取條件的選擇

常用于硝基咪唑類藥物分析的提取溶劑主要有乙酸乙酯、乙腈、甲醇等。本研究先后試驗了乙腈、乙酸乙酯、甲醇和二氯甲烷，結(jié)果表明，4種提取劑對硝基咪唑類藥物均有很好的提取效率。但考慮到二氯甲烷比重大，提取離心后上清液中仍會有樣品殘渣懸浮，轉(zhuǎn)移較為費力且毒性較大；甲醇沉淀蛋白不完全離心靜置后仍有白色絮狀物產(chǎn)生，不利于之后的凈化環(huán)節(jié)；乙酸乙酯脂溶性較強，提取脂溶性雜質(zhì)較多，不利于濃縮。結(jié)合試驗操作簡便性與樣品基質(zhì)類型，最終選擇乙腈作為提取劑。

本試驗通過對陰性樣品添加分析物，比較了一次性加入20 mL 乙腈均質(zhì)提取與分兩次每次各10 mL 加入乙腈均質(zhì)提取之間的提取效率差異，結(jié)果表明，兩種方式的回收率基本持平。樣品再次加入20 mL 乙腈，回收率不變。因此，在保證結(jié)果準確的前提下，為提高檢測效率，標準選擇一次性加入20 mL 乙腈即可提取完全。考慮到水和提取溶劑間極性的差異，粉劑樣品中含水量的不同很可能影響硝基咪唑類藥物的提取效率。以荊防解毒散樣品為例，向樣品中加適量蒸餾水浸泡，采用20 mL 乙腈進行提取。結(jié)果表明，樣品中含水量上升會導致雜質(zhì)提取較多，引起硝基咪唑類藥物提取效果的降低。因此，試驗對于粉劑樣品采用乙腈直接提取，針劑和酊劑樣品含有一定水分，采用均質(zhì)提取前需要加入5 g 氯化鈉和乙腈進行鹽析提取。

2.3 凈化方式的選擇（見圖1、圖2）

由于很多獸藥中含有中藥成分，在生產(chǎn)過程中需經(jīng)過煎煮、蒸餾、添加輔料等制作工藝，基質(zhì)較為復雜，所以選擇固相萃取柱進行凈化。在500 μg/kg 添加水平時，采用不同類型的固相萃取柱，包括C18柱（反相萃取柱）、氧化鋁柱（正相萃取柱）和SCX 柱（硅膠基質(zhì)強陽離子交換柱）。以荊防解毒散為例，各化合物的凈化效果見圖1。

由圖1 可知，用C18柱凈化效果較差，基質(zhì)影響比較嚴重；用硅膠柱和氧化鋁柱處理，8種藥物的絕對回收率均小于60%；用SCX 柱不僅可以消除干擾，同時8 種硝基咪唑類藥物回收率均在70%～90%以上。強陽離子交換柱上的磺酸基能有效地吸附質(zhì)子化的硝基咪唑類藥物，即使是極性強的有機溶劑亦不能洗脫。用丙酮、甲醇可以淋洗掉大部分干擾成分，然后用5%氨水-甲醇置換洗脫目標分析物。本試驗選用6 mL 500 mg 的SCX 強陽離子交換柱，5 mL丙酮和5 mL甲醇淋洗雜質(zhì)，最后用氨水-甲醇（5+95）洗脫并收集。

圖1 8種硝基咪唑類藥物凈化效果比較Fig.1 Comparison of purification effects of eight nitroimidazoles

由圖2 可知，為達到更好的凈化效果和更高的洗脫比例，試驗對洗脫體積采用分段收集的方式進行考察，當洗脫體積為5 mL時凈化柱的洗脫比例均小于5%，第6 mL時已無任何目標物流出。同時，硝基咪唑類藥物熱穩(wěn)定性差，氮吹步驟應注意不能將其完全吹干，若完全吹干就會降低方法的回收率，尤其是卡硝唑吹干后會損失80%。

圖2 8種硝基咪唑類藥物的梯度洗脫曲線（n=3）Fig.2 Gradient elution curves of eight nitroimidazoles(n=3)

2.4 儀器條件的優(yōu)化（見圖3）

采用不接分析柱的方式向質(zhì)譜系統(tǒng)注入1 mg/L 的標準溶液，進樣量為1 μL。確定各化合物的最佳質(zhì)譜分析條件，包括離子源溫度、毛細管溫度、加熱模塊溫度、加熱氣流速、干燥氣流速、氮氣流速、選擇特征離子對、Q1 和Q3電壓、碰撞能量等。各化合物的標準溶液和HPLC的流動相溶液混合進入ESI 電離源，在正負離子同時掃描方式下進行一級全掃描質(zhì)譜分析，其分子離子峰[M+H]+峰響應值最高。在正離子模式下對[M+H]+峰進行子離子掃描得到主要的子離子，并選擇響應值高的子離子進行碰撞能量的優(yōu)化，最終確定多反應監(jiān)測的離子對及碰撞能量，8種硝基咪唑混合標準溶液的MRM色譜圖見圖3。

圖3 8種硝基咪唑混合標準溶液的MRM色譜圖Fig.3 Quantiativeion chromatogramsof eightmixedstandardsolution of nitroimidazole

2.5 基質(zhì)效應（見圖4）

圖4 8種硝基咪唑基質(zhì)效應Fig.4 Matrix effects of eight nitroimidazoles

基質(zhì)效應（ME）是指色譜分離時共洗脫的物質(zhì)無法更改待測成分的離子化效應，所引起的信號的抑制或提高。基質(zhì)效應影響大時會降低方法的靈敏度，影響方法的準確性，給測定帶來誤差。因此，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法開發(fā)和確證過程中需要對ME（ME=（基質(zhì)匹配標準曲線的斜率/純?nèi)軇藴是€的斜率）×100%）做出評價。一般認為，基質(zhì)效應在85%～115%之間不明顯。考慮到獸藥基質(zhì)復雜，容易對目標物產(chǎn)生干擾，文章通過配制標準工作曲線和基質(zhì)匹配校正曲線，以峰面積為縱坐標、質(zhì)量濃度為橫坐標作圖，以基質(zhì)匹配校正曲線和標準曲線斜率的比值來考察化合物的基質(zhì)效應。由圖4可知，經(jīng)此方法凈化所得的樣液不存在明顯的基質(zhì)效應。因此，本方法可采用溶劑標準溶液進行準確定量。

2.6 方法學評價

2.6.1 線性關系、檢出限和定量限（見表2）。

表2 8種硝基咪唑類藥物的線性范圍、線性方程和相關系數(shù)Tab.2 Linear equations,correlation coefficients of eight nitroimidazole

上述方法所確定的試驗條件下，分別配制濃度為10、20、50、100、200、500 μg/L 6 個標準系列進行測定，以定量離子的響應峰面積（y軸）對相應的質(zhì)量濃度（x軸，μg/L）作圖。由表2 可知，8 種硝基咪唑在10～500 μg/L 范圍內(nèi)時，定量離子的響應峰面積和樣品濃度之間有良好的線性關系，其相關系數(shù)均大于0.999。參考GB/T 27417—2017《合格評定化學分析方法確認和驗證指南》中目視評價法評估LOD，從可信性考慮確定LOQ的方法，試驗以空白添加法，并根據(jù)前處理過程提取凈化的稀釋倍數(shù)以及進行測定時所受的干擾情況，確定方法的檢出限為0.02 mg/kg，定量限為0.05 mg/kg。

2.6.2 回收率和精密度（見表3）

表3 8種硝基咪唑類藥物的平均加標回收率和相對標準偏差（n=6）Tab.3 Average spiked recoveries(A.R.)and relative standard deviations(RSDs)of eight nitroimidazole(n=6)

選取不含8 種硝基咪唑的4 種代表性基質(zhì)樣品，即魚腥草注射液、硫酸新霉素可溶性粉、荊防解毒散和白頭翁口服液為空白樣品基質(zhì)，在1、2、10倍定量限的添加水平上進行添加回收率試驗，每個水平重復做6次，測得本試驗方法的回收率范圍為84.1%～101.6%，精密度范圍為2.74%～11.60%。

2.7 實際樣品的測定

為評價該方法的有效性，隨機對送檢的止瘧散、清瘟敗毒散等20份獸藥制劑樣品進行檢測，結(jié)果有1份樣品清瘟敗毒散檢出甲硝唑，樣液經(jīng)稀釋進樣，含量最終確定為220 mg/kg。

3 結(jié)論

試驗應用SCX 固相萃取凈化技術(shù)，以高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了獸藥制劑中8種硝基咪唑類藥物的檢測方法，操作簡便、快速、靈敏度高，可為打擊獸藥制劑中非法添加硝基咪唑類藥物的制假行為提供有力的技術(shù)支持。