高效液相色譜法檢測豬肉中4 種氟喹諾酮類藥物殘留方法的優化

田雨超，谷學佳，薛 麗

（1.北京市昌平區農產品監測檢測中心，北京 102200；2.北京市大興區農業農村局動物疾病控制中心，北京 102600）

喹諾酮類藥物（4-quinolones）是人工合成抗菌藥，以抑制細菌的DNA回旋酶為機理，抗菌作用強大，抗菌譜較廣。一般將這類藥物分為4代，從第3代開始加入氟原子，稱為氟喹諾酮類。至今已經有20個氟喹諾酮類藥物品種上市，大多用于畜禽和水產養殖行業。氟喹諾酮類藥物在獸醫臨床上最常用的有諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、丹諾沙星、馬波沙星等[1]。氟喹諾酮類藥物常見的不良反應為幼畜軟骨變性，大量使用會產生結晶損傷尿道及胃腸道反應。這類藥物的不正確使用和不遵循休藥期會導致藥物殘留，也會使致病菌產生耐藥性，間接危害人類健康[2]。該藥物長期大量累積會造成肝損害，危及生命。多個國家和地區均規定了氟喹諾酮類藥物的最高殘留限量[3]。國外對動物食品中喹諾酮類藥物殘留的研究主要集中在前處理方法以及新材料的應用，或者開發對多種類藥物殘留的一次性綜合檢驗新方法，如微生物法的應用等[4-7]；而國內研究則集中在樣品前處理方法的條件優化上，一般標準方法的操作步驟及色譜條件[8]，很多細節甚至關鍵步驟需要操作者在實際應用中去摸索。標準方法經改進細化，不僅成本較低、前處理簡單易行，而且給基層操作者帶來方便和可應用性參考。根據基層檢測單位的實際情況，為節省成本和提高工作效率，優化色譜條件和簡化前處理步驟成為首選改進因素。目前，在動物產品的檢測中，很多推薦使用液相色譜-串聯質譜法。但由于基層單位儀器設備條件有限，《動物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測高效液相色譜法》（農業部1025 號公告-14-2008）[9]成為基層單位主要檢測方法。本試驗以此標準為基礎，簡單細化了試驗前處理步驟，優化了檢測過程，減少所需耗材較大幅度降低成本，尤其對大批量樣品檢測，節省了處理時間。本方法的靈敏度和回收率均可滿足我國現行獸藥殘留檢測分析的要求。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗使用的豬肉購自二商大紅門五肉聯，經檢測，樣品均不含諾氟沙星、環丙沙星和恩諾沙星、沙拉沙星藥物殘留。

1.2 儀器與試劑

高效液相色譜儀1260（熒光檢測器）（安捷倫）、B-400組織搗碎機（瑞士步琦）、GT10-1高速臺式離心機（北京時代北利離心機有限公司）、CAX-371 高速冷凍離心機（TOMX）、ME104E/02 天平（Mettler Toled）、TTL-DCII 氮吹儀、MX-F 漩渦振蕩器（Scilogex）、LPD2500 多管混合儀（萊普特科學儀器（北京有限公司））、Eppendorf 微量移液器（Thermo Finnpiptte）、KS康氏振蕩器；PHS-3C pH計（雷滋）、ME55 型電子天平（瑞士梅特勒－托利多儀器有限公司）、超聲波儀、Waters固相萃取柱HLB（3 mL）。

乙腈、甲醇、異丙醇（色譜純，Fisher Chemical）；磷酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；三乙胺（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；磷酸二氫鉀（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；氯化鉀（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；氫氧化鈉（分析純，北京化工廠）；超純水；蒸餾水（屈臣氏）。

標準品：達氟沙星標準品，純度94.27%；恩諾沙星標準品，純度99.00%；環丙沙星標準品，純度92.31%；沙拉沙星標準品，純度85.82%，均購自Dr.Ehrenstorfer GmbH。

1.3 試液配制

環丙沙星、恩諾沙星是光敏性藥物，應避光保存。配制過程中應在暗處進行，防止藥物光解，配制完后儲存在棕色避光瓶中。

分別稱取對照品恩諾沙星10.00 mg、環丙沙星11.10 mg、沙拉沙星10.95 mg，置于同一個10 mL 容量瓶中，使用0.03 mol/L 的氫氧化鈉溶液溶解定容至刻度，制得質量濃度均為1 g/L 的混合儲備溶液。準確稱取達氟沙星對照品達氟沙星12.69 mg，0.03 mol/L 的氫氧化鈉溶液溶解定容至10 mL，使其質量濃度為1 g/L，置2～8 ℃冰箱中保存，備用，有效期3個月。取上述恩諾沙星、環丙沙星和沙拉沙星的混合儲備液1.00 mL，達氟沙星儲備液0.20 mL，置于同一個10 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配置成恩諾沙星、環丙沙星、沙拉沙星的質量濃度為100 mg/L，達氟沙星質量濃度為20 mg/L 的混合標準溶液。取上述混合儲備液1.00 mL，置于1 個10 mL 容量瓶中，使用乙腈定容至刻度，配置成恩諾沙星、環丙沙星、沙拉沙星的質量濃度為10 μg/mL，達氟沙星質量濃度為2 mg/L 的混合標準溶液。使用流動相配制成所需要濃度的混合標準溶液以備使用，標液配制稀釋級不要太大，標準曲線濃度盡量不要從上一濃度梯度稀釋，避免標液配制出現偏差。

5.0mol/L 氫氧化鈉溶液：取氫氧化鈉飽和液28 mL，加水稀釋至100 mL，混勻（根據需要適量配制）。

0.03mol/L 氫氧化鈉溶液：取5.0 mol/L 氫氧化鈉液0.6 mL，加水稀釋至100 mL，混勻。

磷酸/三乙胺溶液：取濃磷酸3.4 mL，加水稀釋1 000 mL，使用三乙胺調pH 值至2.4?，F用現配（易產生沉淀）。

磷酸鹽緩沖溶液（用于肌肉、脂肪組織）：取磷酸二氫鉀6.8 g，加水溶解并稀釋至500 mL，使用5.0 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至7.0。

洗脫液：取乙腈20 mL，使用0.05 mol/L磷酸/三乙胺溶液稀釋至100 mL，混勻。取乙腈18 mL，使用0.05 mol/L磷酸/三乙胺溶液稀釋至100 mL混勻，備用。

1.4 樣品處理

稱取（2.00±0.02）g 豬肉樣品，加10.0 mL 磷酸鹽緩沖液（pH 值=7），渦旋混勻，中速振蕩5 min，10 000 r/min 離心，取上清液到新離心管待用，再向原離心管加磷酸鹽緩沖液10.0 mL，渦旋混勻，中速振蕩5 min，10 000 r/min 離心，2次上清液合混勻，使用濾紙過濾，備用。

標記好的固相萃取柱先依次用甲醇、磷酸鹽緩沖液各2 mL預洗。取上清液5 mL過柱，使用1 mL水淋洗，擠干。用流動相1 mL洗脫，擠干，收集洗脫液。經過濾膜過濾后作為試樣溶液，供高效液相色譜法測定。

1.5 色譜條件

流動相A為0.05 mol/mL磷酸溶液/三乙胺，D為乙腈，使用前過濾脫氣；流速0.8 mL/min，柱溫：室溫，進樣量：20 μL；熒光檢測器，激發波長（Kex）248 nm，發射波長（Kem）450 nm。色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18 柱（250 mm×4.6 mm，5μm）。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理條件的優化

2.1.1 樣品制備環節

一般基層檢測樣品量大，普通的樣品粉碎機費時費力，且得到均質效果不理想的樣品，只能通過勻漿機進一步均質。在通過實踐和同其他機構借鑒經驗，本試驗使用的瑞士步琦組織搗碎機B-400，30 s可以制備好樣品，樣品顆粒可達0.3 mm，甚至可以大塊冷凍樣品處理。

檢測中可以直接稱取上述制備樣品，節省了勻漿步驟。本方法在樣品制備過程中已經達到勻漿機效果，還避免2次勻漿造成藥物損失，減少勻漿操作步驟時間。

2.1.2 組織提取液凈化

動物源食品中基質干擾復雜，富含大量脂肪和蛋白質，因此對豬肉樣品選擇要求瘦肉不含有筋膜樣品，但實際檢測中有時無法得到理想樣品。按照農業農村部的方法，樣品組織提取液一般不干凈呈現渾濁狀態，直接加到固相萃取柱，會堵塞小柱，大大增加凈化時間，并且造成藥物回收率低、不穩定，導致準確率降低、殘留檢測難度增大。離心時采用高速冷凍離心機，低溫可使脂肪凝固，還能減少藥物因為離心過程中溫度過高帶來的損失。一般使用乙腈飽和的正己烷溶液去除脂肪等干擾物質，效果雖然較好，但是多了一步有機試劑，費時、費力、成本提高。本試驗采用上述方法進行上清液用濾紙過濾，可以過掉大部分殘渣，用濾紙過濾需要過柱體積的上清混合液回收率較高，不影響檢測結果的準確性。經過濾后4 種農藥回收率提高7.7%～13.9%，提高了過柱速度。

本試驗選用固相萃取，填充劑基質是聚合物，作用和效果同C18（填充劑基質是硅膠）的固相萃取小柱，具有高吸附容量，實際工作中活化和淋洗液體積可適當調整并不影響回收率。

2.1.3 試劑配制和材料準備（見表1）

試驗過程中，從標準品、提取液和凈化液配制到流動配制相都需要操作者自己配制，每個細微環節都會直接影響試驗結果的準確性。標液配制過程中根據《中國藥品檢驗標準操作規范》及GB/T 601—2002《化學試劑標準滴定溶液的制備》確定選用合適量程的天平，稱取量要根據化學式及純度進行換算以去除鹽酸根。標準中只有在標準曲線配制時提到了用流動相配制，根據經驗建議小于1 mg/L 均用流動相配制，否則峰型不好，尤其對環丙沙星影響明顯會使峰分叉。

配制時溶液用水的不同，也會影響藥物提取回收率。由表1可知，本試驗比較一級水和蒸餾水，一級水配制磷酸鹽提取液回收率提高了3.3%～11.0%。

表1 樣品前處理條件優化Tab.1 Optimization of sample preparation conditions

由于色譜系統的精密性和對結果分析的準確性要求，對樣品的過濾顯得尤為重要，過濾可以保護色譜柱系統和色譜柱，延長柱子的使用壽命，改善數據的精確度。過濾可以清除由于摩擦長生顆粒而引起的壓力波動和無規律的雜質引起的極限波動，可以消除由于存在氣泡對檢測系統的干擾。本試驗比較尼龍膜和聚偏氟乙烯膜（PVDF）。PVDF 膜使藥物提取效率提高了3.3%～8.9%，尤其對達氟沙星明顯提高。

2.2 色譜條件的選擇（見圖1、圖2）

圖1 流動相20∶80色譜圖Fig.1 Chromatogram of mobile phase 20∶80

圖2 流動相18∶82色譜圖Fig.2 Chromatogram of mobile phase 18∶82

由圖1、圖2 可知，流動相中乙腈的比例越高，4 種目標物保留時間越短。考慮到干擾雜質的出峰時間和各峰的分離度，選擇乙腈和水相的體積比為20∶80（標準流動相乙腈和水相的比例18∶82）。0.1 mg/L 的混合標準溶液測得環丙沙星的保留時間為4.848 min，達氟沙星為5.255 min，恩諾沙星為5.976 min，沙拉沙星為8.862 min，峰形尖銳，分離完全，無干擾峰出現。在相同色譜條件下，本試驗得到的保留時間比標準方法提前3.4 min。此條件下，樣品標液添加回收也得到同樣色譜峰，沒有樣品基質干擾。

2.3 方法的線性范圍與檢出限（見表2）

表2 方法的線性范圍與檢出限Tab.2 Linear range and detection limit of the method

由表2 可知，環丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星在5～500 μg/L濃度范圍內，達氟沙星在1～100 μg/L線性關系良好。本試驗采用通過大量分析樣品空白樣品，獨立測試次數大于10 次，計算檢測結果的標準偏差（S），方法檢出限結果表示為：樣品空白值+4.65 S。

2.4 方法的回收率與精密度（見表3）

表3 方法的回收率與精密度Tab.3 Method recovery and precision

空白豬肉待測樣品中分別添加3個濃度水平的混合標準液，各6個平行。由表3可知，環丙沙星3個濃度回收率在76.5%～101.8%，變異系數在1.8%～3.8%，批間變異系數為3.2%～5.6%；達氟沙星回收率在80.8%～87.8%，變異系數在1.3%～1.7%，批間變異系數為2.8%～6.6%；恩諾沙星回收率在77.5%～107.9%，變異系數在2.2%～6.4%，批間變異系數為5.2%～7.8%；沙拉沙星回收率在66.1%～88.7%，變異系數在1.6%～4.5%，批間變異系數為4.5%～7.1%?；厥章始芭鷥茸儺愊禂稻诜椒ㄒ髢?。

3 結論

目前，大多檢測方法包含樣品制備、提取、凈化和濃縮。在提取同時把與蛋白質結合的藥物解吸附成游離藥物，凈化時除去樣品中的干擾雜質，濃縮時達到儀器可檢測的濃度范圍。本試驗在原有方法基礎上根據實驗室現有條件在各個步驟中尋找可以改進優化的點。本試驗選擇豬肉組織，基本組成為水分、蛋白質、脂質、碳水化合物、礦物質、維生素和酶類等，相對雞肉、牛肉及豬肝等樣品雜質干擾較少。不同組織的功用不同，在結構特點上存在差異，這些變化可能影響某些藥物的回收率和干擾的檢測選擇并優化樣品前處理方法對結果的準確性尤為重要。

高效液相色譜法在喹諾酮類藥物殘留的檢測中被廣泛應用，農業部1025 號公告-14-2008 也是各檢測單位常用的方法。本試驗以此標準為基礎，簡化了試驗前處理步驟，優化了檢測過程。經多次主要證明改進后優化后的方法成本降低、通用性強、方法靈敏度和回收率均可滿足我國現行獸藥殘留檢測分析的要求，可為基層檢測單位提供參考。