多金屬氧酸鹽抑制酪氨酸酶活性研究進展

王安杏 方向紅 張 慶

（安徽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 環(huán)境與化工學(xué)院，安徽 合肥 230011）

我國果蔬產(chǎn)量位居世界第一，但因保鮮不當導(dǎo)致的果蔬損耗率為20%～30%，每年因此造成的損耗超過4 000億元[1]。酶促褐變是果蔬損耗的主要原因。酶促褐變不僅會影響果蔬外觀和風(fēng)味，還會降低果蔬營養(yǎng)及經(jīng)濟價值。酶促褐變指果蔬中酚類化合物在酚酶催化下氧化成鄰醌類化合物，醌類物質(zhì)經(jīng)過一系列氧化縮合聚合形成褐色產(chǎn)物，從而導(dǎo)致褐變發(fā)生[2]。因此，控制果蔬相關(guān)酶活性是防止和延緩果蔬褐變的重要手段，也是延長果蔬貨架期、保持果蔬品質(zhì)的重要手段。

酪氨酸酶，又稱多酚氧化酶（PPO），是一種含銅多功能氧化酶，主要存在于動植物和微生物中，是生物體合成黑色素的關(guān)鍵酶。在疾病方面，酪氨酸酶活性的異常表達會引起色素沉著性疾病[3]。在食品領(lǐng)域，酪氨酸酶是引起果蔬發(fā)生酶促褐變的主要酶[4]。酪氨酸酶具有單酚酶活性和雙酚酶活性，可先將L-酪氨酸羥基化為L-3，4-二羥基苯丙氨酸（L-DOPA），再氧化L-DOPA為多巴醌，醌是高活性物質(zhì)，能自發(fā)聚合形成黑色素[5]。酪氨酸酶抑制劑是通過降低酪氨酸酶活性而抑制黑色素合成，目前主要有天然提取物[6-7]、有機合成物[8]和無機化合物[9]。目前商業(yè)化的酪氨酸酶抑制劑是曲酸[10]和熊果苷[11]，但熊果苷對細胞有潛在毒性，而曲酸在治療濃度下會引起皮膚過敏[12]。因而開發(fā)新型、安全、高效的酪氨酸酶抑制劑已成為食品保鮮領(lǐng)域的研究熱點。

多金屬氧酸鹽（POM）是一類無機金屬氧簇化合物，由于其獨特的結(jié)構(gòu)和優(yōu)異的性能，不僅廣泛用于工業(yè)催化[13]，而且用于生物醫(yī)學(xué)[14-15]，具有抑菌[16-17]、抗病毒[18]、抗癌[19]、抗糖尿病[20]等特性。此外POM還具有很好的抑酶作用[3]，尤其是對酪氨酸酶的抑制[21]，有望使POM在果蔬保鮮方面應(yīng)用廣泛。

1 多金屬氧酸鹽（POM）對酪氨酸酶的抑制作用

從抑制效果、抑制機理、抑制類型三方面來探討POM對酪氨酸酶的抑制作用。

1.1 抑制效果

POM對酪氨酸酶的抑制效果主要通過酶動力學(xué)法[22-23]研究。酶動力學(xué)法是基于酪氨酸酶催化底物單酚（L-酪氨酸）或雙酚物質(zhì)（L-DOPA）生成的產(chǎn)物在475 nm波長處有最大吸收峰，通過紫外-可見分光光度法測量吸光度，從而測定酪氨酸酶活力。酶動力學(xué)方法主要是通過IC50和抑制常數(shù)等參數(shù)綜合比較不同POM對酪氨酸酶抑制能力大小。

抑制效果實驗主要是通過固定酶量和底物濃度，測定不同濃度抑制劑體系吸光度值隨時間變化的曲線，根據(jù)直線的斜率計算酶活力。以相對剩余酶活力對抑制劑濃度作圖，由圖可知酶活力下降50%對應(yīng)的抑制劑濃度即為半抑制濃度（IC50），一般IC50越小說明抑制劑的抑酶效果好。POM對酪氨酸酶單酚酶活力的影響主要表現(xiàn)為對酶穩(wěn)態(tài)活力的抑制作用，并有遲滯時間，抑制劑對酪氨酸酶二酚酶活力的抑制沒有遲滯過程[24]。

表1 酶動力學(xué)參數(shù)

1.2 抑制類型

抑制類型實驗主要是通過固定酶量，改變底物濃度，測定不同濃度抑制劑體系酪氨酸酶酶活力。可通過雙倒數(shù)作圖法，即以反應(yīng)速率倒數(shù)對底物濃度倒數(shù)作圖，測定抑制劑如何與酶結(jié)合，確定抑制類型。以雙倒數(shù)圖中直線斜率和縱軸截距分別對抑制劑濃度進行二次作圖，可分別求得KI和KIS，從而判斷抑制劑對酪氨酸酶的抑制類型[25]。一般抑制劑對酪氨酸酶的抑制類型有競爭性抑制、非競爭性抑制、反競爭性抑制和混合型抑制[26]。

1.3 抑制機理

抑制機理實驗主要是通過固定底物濃度，改變酶量，測定不同濃度抑制劑體系酪氨酸酶酶活力，以酶活力對酪氨酸酶濃度作圖判斷抑制機理是可逆抑制還是不可逆抑制。可逆抑制中，抑制劑與酶以非共價鍵結(jié)合，通過抑制酶活力而導(dǎo)致催化效率降低，而不是通過減少有效酶量導(dǎo)致酶活力下降[27]。可逆抑制的特點是以酶剩余活力對酶濃度作圖，得到一組通過原點的直線，并且直線的斜率隨抑制劑濃度增大而降低。不可逆抑制中，抑制劑與酶以共價鍵結(jié)合使有效酶量減少而抑制酶活性[28]。不可逆抑制的特點是以酶剩余活力對酶濃度作圖，得到的一組在X軸上截距不同的平行直線，直線在橫坐標上的截距隨抑制劑濃度增大而逐漸增大。

2 不同結(jié)構(gòu)的多金屬氧酸鹽（POM）抑制酪氨酸酶活性

POM主要有六種典型結(jié)構(gòu)[14]，其中在抑制酪氨酸酶活性方面研究較多的是Keggin型[29]和Dawson型[30-31]。

2.1 Keggin型POM抑制酪氨酸酶活性

2.1.1 不同類型Keggin型POM抑酶活性

目前研究較多的抑制酪氨酸酶活性的Keggin型POM主要是磷鎢酸、磷鉬酸和硅鎢酸及其對應(yīng)過渡金屬取代物。其中純POM對酪氨酸酶二酚酶的抑制效果為H3PMo12O40>H3PW12O40>H4SiW12O40，這可能是由于中心原子和配位原子不同使POM具有不同的氧化性和酸性。不同過渡金屬取代POM的抑酶活性具有差異，這可能與過渡金屬的離子半徑有關(guān)。

邢蕊[32]研究發(fā)現(xiàn)甘氨酸基的過渡金屬取代的磷鉬酸鹽對酪氨酸酶二酚酶的抑制效果均優(yōu)于對應(yīng)的過渡金屬取代的磷鉬酸鹽，可能是由于甘氨酸基與雜多陰離子形成無機-有機大分子復(fù)合物，其與酶相互作用產(chǎn)生較大的空間位阻而有效地抑制了酶活性，同時還發(fā)現(xiàn)（HGly）4SiW12O40的抑酶作用強于（HGly）3PW12O40，分析可能是因為反荷離子質(zhì)子化甘氨酸、雜多陰離子電荷數(shù)以及POM還原性差異引起的。

表3 Keggin型POM對酪氨酸酶的抑制作用

2.1.2 影響Keggin型POM抑酶活性的因素

Joscha Breibeck等[33]研究發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)完整的α-Keggin結(jié)構(gòu)的POM對蘑菇酪氨酸酶二酚酶的抑制行為具有電荷依賴性，POM的抑酶能力與其雜多陰離子的凈電荷成反比，對凈電荷較低的K4SiW12O40和Na3PW12O40，POM的抑酶作用被它們顯著的水解作用部分抵消，而對于雜多陰離子電荷數(shù)為5和6的POM對酪氨酸酶二酚酶無抑制作用，甚至具有激活作用。在研究體系（pH=6.8）中，K4SiW12O40部分水解，但仍顯示出最強的抑制作用，而Na3PW12O40由于完全水解為中等活性的物質(zhì)，所以抑酶作用弱于K4SiW12O40。

影響POM抑酶活性的因素主要有中心原子、配原子、反荷離子、雜多陰離子電荷數(shù)、POM酸性、POM氧化還原性質(zhì)等。POM的結(jié)構(gòu)和組成對抑酶活性具有非常重要的影響。然而目前只針對Keggin型雜多陰離子電荷數(shù)這一種因素系統(tǒng)研究了其對POM抑酶活性的影響，未來還需要詳細研究其他因素的影響，便于總結(jié)規(guī)律，為設(shè)計酪氨酸酶抑制劑提供理論依據(jù)。

2.1.3 Keggin型POM抑酶機制

Chi等[34]合成了H3PMo12O40、Na7PMo11CoO40、Na7PMo11ZnO40，通過分子模擬研究了 POM對酪氨酸酶的作用機制，分子模擬研究與三種化合物的體外生物活性有很好的相關(guān)性。分子對接結(jié)果表明三種POM對酪氨酸酶具有很強的結(jié)合能力，POM主要通過與酪氨酸酶中的Cu2+離子及能夠形成陽離子-π和氫鍵的氨基酸殘基的更多相互作用而競爭性結(jié)合酪氨酸酶，從而形成可逆的非共價復(fù)合物。三種POM中H3PMo12O40的抑酶活性最高，可能是因為H3PMo12O40能與酪氨酸酶中的His61 and His85兩種氨基酸殘基形成陽離子-π相互作用，而另外兩種POM僅能與一種氨基酸殘基產(chǎn)生陽離子-π相互作用，所以POM對酪氨酸酶的結(jié)合親和力和抑制能力會降低。

2.2 Dawson型POM抑制酪氨酸酶活性

由表4可知，目前研究較多的抑制酪氨酸酶活性的Dawson型POM主要是磷鉬酸及其過渡金屬取代物，并且對酪氨酸酶二酚酶的抑制均為可逆競爭性抑制。李莉莉等[35]研究了不同數(shù)目釩取代的Dawson型磷鉬酸對酪氨酸酶二酚酶活性的抑制，發(fā)現(xiàn)隨著取代釩原子數(shù)的變化，POM的抑酶活性不同，推測可能是由于不同個數(shù)的釩原子取代影響了POM與酶的結(jié)合方式，從而造成抑酶活性的差異。由表4，根據(jù)IC50值可知取代型Dawson型磷鉬酸的抑酶活性為H8[P2Mo17Zn（OH2）O61]>H8[P2Mo17Cu（OH2）O61]>H7[P2Mo17Fe（OH2）O61]>H8[P2Mo17Mn（OH2）O61]>H8[P2Mo17Co（OH2）O61]>H8[P2Mo17Ni（OH2）O61]>H6[P2Mo18O62]>H8[P2Mo17Cr（OH2）O61]，這可能與過渡金屬元素的離子半徑有關(guān)，也可能與元素的氧化還原電位有關(guān)。Hu等[36]合成了α/β-K6P2W18O62.10H2O，并研究了其對酪氨酸酶單酚酶和二酚酶活性的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)α/βK6P2W18O62.10H2O對單酚酶的抑制作用強于二酚酶，對酪氨酸酶二酚酶的抑制為不可逆非競爭性抑制。

表4 Dawson型POM對酪氨酸酶的抑制作用

3 多金屬氧酸鹽在果蔬保鮮中的應(yīng)用實例

目前POM用于果蔬保鮮的實例并不是很多，主要是用于鮮切蘋果片、藕片、紅毛丹果實的保鮮，并且都是通過浸泡的方式達到保鮮的效果。

Chen等[28]合成了α-Na8SiW11CoO40（SiW11Co），研究了其對蘑菇酪氨酸酶活性的抑制作用及對鮮切蘋果片的保鮮效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SiW11Co能夠有效抑制酪氨酸酶的活性，且存在劑量效應(yīng)，經(jīng)過SiW11Co處理的蘋果片保持了蘋果的營養(yǎng)成分，顯著降低了蘋果的褐變程度，抑制多酚氧化酶的活性，提高過氧化物酶活性，促進酚類化合物和抗壞血酸含量的增加。李莉莉、遲國祥等[37-38]通過測定多項指標評價H8[P2Mo17Mn（OH2）O61]（P2Mo17Mn）對鮮切蘋果的保鮮效果，結(jié)果表明P2Mo17Mn能夠有效減少鮮切蘋果水分的散失，顯著延緩蘋果質(zhì)量的損失和褐變進程，減緩丙二醛含量的增加以及多酚氧化酶活性的增加，促進過氧化物酶活性的增加，保持較好的色澤、香味、硬度和質(zhì)地，延長了蘋果的貨架期。

Xing等[39]研究了Na6PMo11FeO40（PMo11Fe）對蘑菇酪氨酸酶的抑制作用及對藕片保鮮的影響，發(fā)現(xiàn)PMo11Fe對酪氨酸酶活性有顯著的抑制作用，且存在劑量效應(yīng)。通過測量相關(guān)生理生化指標說明PMo11Fe能夠顯著減緩藕片褐變速度，抑制多酚氧化酶活性，增強過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性，維持較高水平的谷胱甘肽、抗壞血酸和蔗糖。鄭阿萍[40]研究了POM對紅毛丹果實保鮮的簡單應(yīng)用實驗，使用POM浸泡新鮮紅毛丹，取出風(fēng)干、貯藏，觀察果實褐變程度，發(fā)現(xiàn)PW12的保鮮效果優(yōu)于其他三種POM。

4 總結(jié)與展望

POM在果蔬保鮮領(lǐng)域的應(yīng)用范圍應(yīng)進一步擴展，而不僅僅局限于蘋果、藕片等。此外應(yīng)該詳細研究不同因素對POM抑制酪氨酸酶活性的影響，確立POM對酪氨酸酶的結(jié)構(gòu)-抑制關(guān)系。POM和酪氨酸酶在分子水平上的反應(yīng)機制基本未知，需從分子水平上開展POM對酪氨酸酶的作用機制研究，為設(shè)計新型、安全、高效的酪氨酸酶抑制劑提供理論依據(jù)。

目前已經(jīng)用于果蔬保鮮應(yīng)用的POM都是通過浸泡的方式達到保鮮效果，POM容易滲透到果蔬組織內(nèi)部，POM在生物體內(nèi)經(jīng)過代謝是否會產(chǎn)生對生物體不利的衍生物和有毒物質(zhì)尚不清楚，應(yīng)探索新的保鮮方式，如將POM與其他材料復(fù)合合成新型食用膜。盡管POM的生物活性已經(jīng)研究了很多年，但相關(guān)毒理學(xué)研究報告相對較少，所以應(yīng)加強POM在生物體內(nèi)的活性研究，進行毒理學(xué)分析，探索POM對生物體健康的影響，以期篩選出安全、高效的果蔬保鮮劑。