發菜多糖的提取、純化及生物活性研究進展

朱蓉靜，陳雪峰，劉 歡，孟廣燕，黨 玥

（陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西西安 710021）

多糖在自然界分布較為廣泛，其不僅是動物、植物、藻類等有機體的重要組成成分，還具有抗炎、抗氧化、抗輻射、抗病毒、抗腫瘤、降血糖血脂、免疫調節、保肝、美容等多種活性功能[1-2]。近年來，藻類多糖的抗病毒、抗氧化和降血糖等功能逐漸被人們所發現。發菜（Nostoc flagelliforme，發狀念珠藻）與地木耳、葛仙米同屬于藍藻（Cyanobacteria），且都是陸生念珠藻（Nostoc），既可食用，也可作為藥用[3]。從《野菜博錄》等古書中可了解到，發菜歷來就是我國的傳統珍肴[3]，而且還具有消熱解毒、調理腸胃和降血壓等藥用功效[4]。發菜中含有多糖，鉀、鈣等元素以及蛋白質等多種成分[5]。其中，多糖作為發菜中的重要活性成分之一，具有抗氧化、免疫調節、抑菌抗炎、抗病毒、抗腫瘤等活性功能，因此，具有良好的開發應用前景[6-7]。本文主要對發菜多糖的提取、分離和純化、分析鑒定、生物合成以及生物活性的相關研究進展進行了綜述，以期為發菜多糖的深入研究和開發利用提供理論依據。

1 發菜多糖的提取、分離純化和分析鑒定

1.1 發菜多糖提取

為了進一步研究發菜多糖的結構、性質和活性功能，首先需要采取合適且高效的方法提取發菜多糖。目前，發菜多糖的提取方法主要有熱水浸提法、超聲波法、絮凝純化法及酶法等。

1.1.1 熱水浸提法 熱水浸提法是一種傳統的多糖提取方法，也是研究中被使用最多的方法。由于發菜多糖易溶于熱水，故可利用該方法從發菜細胞中提取得到發菜多糖[8]。提取過程中，料水比、提取溫度和提取時長等條件均會影響提取的效果。陳雪峰等[9]采用該方法提取發菜細胞中的發菜多糖時篩選出最佳實驗條件，即料水比為1:120（g/mL），80 ℃條件下提取4 h，最終發菜多糖得率為5.8%。林永賢等[8]探究了不同料水比、提取溫度和時間以及提取次數條件下發菜多糖得率的大小，最終確定最佳工藝條件，即料水比為1:90（g/mL），在80 ℃條件下提取70 min，共提取3次，得到的發菜多糖得率為14.1%。對比研究發現，在料水比、溫度條件相近的情況下，通過減少每次提取的時間而增加提取的次數能使得發菜多糖的得率有所提高。但由于發菜中含有大量的葉綠素、藻藍素、小分子糖類和脂類物質等雜質，因此直接用熱水浸提法提取容易造成多糖得率總體較低，故可先利用石油醚脫除色素等雜質分子，并用乙醇去除可溶性的小分子糖，再采用熱水浸提法，從而進一步提高發菜多糖得率[10]。

1.1.2 酶解法 酶解法是利用蛋白酶等破壞細胞結構來促進多糖的釋放，從而使得多糖提取率得以提高的一種多糖提取方法[11]。劉鼎闊等[12]在提取發菜多糖時，將發菜干粉脫脂后，先后利用胰蛋白酶和堿性蛋白酶對發菜樣品進行水解。酶解法不僅提高發菜多糖的水解度，而且得到的多糖分子量較小，也避免化學法提取過程中產生的化學物質殘留和污染。

1.1.3 超聲波法 超聲波法是一種新型天然物質提取方法，利用該方法提取發菜多糖的原理是利用超聲波的強烈振動使發菜細胞的細胞壁結構被破壞[13]，使多糖等物質在短時間內被釋放出來，從而提高多糖的提取效率。盡管與其他方法相比較超聲波法具有低能耗、高效率的優點[14]，但研究發現提取過程中超聲時間越長越容易使多糖降解[15]，不但會導致多糖提取率降低，還會影響多糖的生理活性，因此，利用超聲波法提取多糖時還應盡量減短時間[16]。李卓等[17]在提取發菜多糖時采用超聲波法，并用水為提取溶劑，通過探究料液比、提取溫度和時間以及超聲波功率四種因素對發菜多糖提取率的影響，確定了最適條件，即料液比為1:50（g/mL），在100 W的超聲波功率和60 ℃的溫度條件下提取20 min后，發菜多糖的提取率為7.369%。

1.1.4 絮凝純化技術 絮凝純化技術主要通過高分子絮凝劑對固體微粒及大分子雜質進行沉淀，從而同時達到提取和純化目的[18]。使用該方法不僅能夠降低生產成本，而且提取步驟簡易方便、安全，效率較高[19]，還能有效去除蛋白質等雜質分子，有效保留所需成分[20]。作為一種新型技術，絮凝純化技術近年來被廣泛應用于多糖等有效成分的提取純化中。其中，殼聚糖是絮凝純化過程中較為常用的一種絮凝劑，其來源廣泛，安全無毒性，且同時具備吸附絮凝和電中和絮凝作用[21]。張喜峰等[18]利用殼聚糖作絮凝劑，對樣品溶液進行絮凝提取純化，探究在不同的多糖提取液pH、殼聚糖用量以及絮凝溫度和時間條件下發菜多糖保留率的大小，并最終確定了最佳條件，即多糖提取液pH為7，殼聚糖用量為1.5 mg/mL，40 ℃條件下提取60 min，發菜多糖的保留率達到了90.3%，蛋白質去除率達到了75.1%，且與傳統的熱水浸提法得到的多糖相比，絮凝提取純化的多糖在一定濃度范圍內對體外自由基的清除能力有所提高。由此可見，使用該方法的提取純化效果較為理想。

1.2 發菜多糖的分離和純化

經過初步提取得到的粗多糖中通常含有多種雜質分子，因此還需要進行蛋白質、色素、脂類物質及無機鹽等雜質的去除，并采用柱層析法達到進一步純化的目的。

1.2.1 除蛋白 去除發菜粗多糖中的蛋白質最常用的方法是Sevag法和三氯乙酸法[9]。Sevag法較三氯乙酸法更加溫和，需要重復多次才能達到較好的除雜效果，且多次處理還容易造成多糖損失。陳雪峰等[9]采用Sevag法除蛋白時，共重復處理4次才使得CHCl3與水的界面無蛋白質沉淀。梁文裕等[10]比較兩種方法時發現Sevag法試劑用量大，重復次數多，耗時耗力，故最終采用了更快速簡便的三氯乙酸法，使發菜粗多糖的蛋白質含量由7.508 mg/mL降至0.173 mg/mL，蛋白質去除率為97.7%，達到了較好的除雜效果。三氯乙酸法相對Sevag法除蛋白作用更強，但在采用該法時應注意控制三氯乙酸的濃度，防止其對發菜多糖的結構產生破壞作用。

1.2.2 除色素、脫脂 發菜粗多糖中的藻藍素、葉綠素等色素分子可利用石油醚除去[10]，此外，利用柱層析法也可在純化的過程中去除色素分子[9]。對于脫脂，石油醚除了能脫色素外還具有脫脂的作用[10]。CO2超臨界萃取技術作為一種新型分離純化技術，也能夠高效分離脂類物質，該方法不但具有簡單易操作、高效率、高選擇性等優點，還能有效保留發菜多糖的有效成分，是一種理想的發菜粗多糖脫脂除雜方法[22]。劉鼎闊等[12]采用CO2超臨界萃取技術對發菜多糖進行脫脂時，將萃取溫度設置為58 ℃，萃取壓強設置為35 MPa，該條件下靜態萃取l0 min后設置CO2流量為15 L/h，再動態萃取125 min，除雜效果較好。

1.2.3 透析法 利用透析法分離純化時需要選擇一種合適的透析膜[23]，陳雪峰等[9]在利用該方法純化發菜多糖時，對大小適宜的選擇性半透膜中的多糖樣品濃縮液用去離子水進行透析、除雜，經過48 h后得到了純化后的發菜多糖。利用透析法在去除無機鹽的同時，還可除去像單糖等小分子雜質，從而提高發菜多糖的純度[11]。

1.2.4 柱層析法 常用于分離純化發菜多糖的柱層析法主要有離子交換柱層析法和凝膠柱層析法。陳雪峰等[9]在研究中將發菜胞外粗多糖依次通過DEAE-52纖維素離子交換柱和Sephadex G-100凝膠柱，最終分離純化得到一種酸性多糖，并對莢膜粗多糖用同樣的方法進行了分離純化，得到了兩種酸性多糖和一種中性多糖。秦韶燕[24]對自養發菜的多糖進行分離純化時，以多糖得率和蛋白質含量為評價指標比較了發菜多糖分別經過4種不同類型的樹脂的（DEAE-Cellulose、DEAE52、DEAE01和DEAESephroseCL-6B）分離純化效果，結果顯示，相對于其他三種樹脂，DEAE-Cellulose對發菜多糖的分離純化效果是最理想的。除了樹脂類型之外，洗脫劑和洗脫方式的差異也都會造成離子交換樹脂分離純化效果的不同，因此，秦韶燕等[25]在采用DEAE-Cellulose對發菜多糖進行分離純化時探究了DEAE離子交換色譜純化的最佳條件。結果表明，采用OH-型離子交換樹脂，并在洗脫劑NaCl濃度為0.2 mol/L時，多糖純度達到81.02%，較原來提高了近50%，效果最佳。

1.3 發菜多糖的分析鑒定

1.3.1 含量測定 在發菜多糖含量測定的研究中通常使用的方法為苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法[9-10]。相對于其他方法，這兩種方法具有操作簡易、檢測速度快的優點，因此在各類研究中被廣泛應用[26-27]。白雪娟等[28]為確定合適的水溶性發菜多糖含量測定方法，對比了苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法。結果表明，這兩種方法的測定結果的準確性和穩定性均較好，但在一定程度上均會受發菜培養基中添加的無機鹽離子的影響，因此在測定培養液中多糖的含量前應先去除鹽離子。此外，相對于蒽酮-硫酸法，苯酚-硫酸法更適用于多糖含量較少的樣品的測定。

1.3.2 純度鑒定 多糖作為高分子化合物，即便是純品，其微觀結構相對來說也無法達到均一程度，因此在純度鑒定過程中，無法用常用的化合物純度標準來判斷多糖純度的大小[29-30]。一般用于鑒定多糖純度的方法有柱色譜法、超離心法、紫外檢測法、比旋度和電泳法等[26]。發菜多糖的純度鑒定常用的方法為凝膠柱層析法和紫外光譜分析法。例如，秦韶燕[24]將純化得到的發菜多糖進行凝膠過濾，得到的凝膠柱洗脫曲線是單一的對稱峰，則說明該發菜多糖的分子量大小是相對均一的。于海峰等[31]對純化得到的發菜多糖進行紫外光譜分析，且紫外光譜圖顯示在260以及280 nm處均無吸收峰，則說明該多糖樣品沒有蛋白和核酸雜質包含其中，純度相對較高。

1.3.3 分子量測定 在多糖分子量測定研究中一般采用高效液相色譜法、凝膠色譜法以及滲透壓法[26]。測定發菜多糖的分子量時通常采用高效液相色譜法[32]。此外，采用凝膠過濾法也可以方便快捷地測定發菜多糖的分子量[33]。目前已確定的部分發菜多糖分子量見表1。于海峰等[31]采用高效液相色譜法對分離純化得到的兩種多糖的表觀分子量進行了測定和分析，結果如表1中所示，其中野生發菜多糖NFPS0的表觀分子量與液體懸浮培養發菜多糖NFPS2的表觀分子量在同一數量級范圍內，差異很小，且與Kenji等[32]報道的野生發菜多糖Nostoflan分子量也在同一數量級范圍內。

1.3.4 結構測定 多糖的結構是其活性功能的基礎，因此多糖結構的測定對于研究其生物活性具有重要作用。對于多糖的初級結構（即一級結構）和高級結構（包括二級、三級、四級結構），在測定時所采用的方法是不同的。一級結構的測定主要有三個方面，即糖苷建的構型、單糖的組成和數量（或比例）[35-36]。通常可利用三氟乙酸將發菜多糖完全酸水解后，再采用高效液相色譜或氣相色譜法進行單糖組成的測定和分析[36]。目前已確定的部分發菜多糖的單糖組成及比例見表1。如表1所示，于海峰等[31]、Kenji等[32]以及Huang等[34]測得的野生發菜多糖組成均一致。此外，發菜多糖的結構與培養環境有密切聯系。路苗等[35]研究鹽脅迫對發菜多糖結構的影響時，利用柱前衍生高效液相色譜定性定量分析了發菜胞外多糖的單糖組成和摩爾比例，通過比較發現，正常培養條件和鹽脅迫培養條件下，發菜細胞多糖的單糖組成種類一致，但對應的比例差異明顯，如表1所示，鹽脅迫培養條件下葡萄糖和木糖的含量降低，而甘露糖、鼠李糖、半乳糖及葡萄糖醛酸含量提高。逆境條件下發菜多糖的單糖組成比例發生改變，這實際上也是發菜細胞對逆境脅迫的一種抵御方式。對于發菜多糖的糖苷鍵構型，通常需要經過酶解、高碘酸氧化、剛果紅實驗、元素分析及紅外光譜分析等來進行研究分析[24]。秦韶燕等[24]在分析發菜多糖的糖苷鍵時，通過剛果紅實驗證明了發菜多糖具有有序的三螺旋結構，并采用高碘酸鈉氧化法證明了該發菜多糖中包含了1→6、1→2或1→4糖苷鍵，同時也可能有1→3糖苷鍵。此外，還通過酶解反應證明了發菜多糖中有 β-(1→4)糖苷鍵，而沒有α-糖苷鍵，此結果與于海峰[31]通過紅外光譜分析得到的發菜多糖只含有β-糖苷鍵的結果一致。通常具β-螺旋型立體結構的多糖其活性要高于α-螺旋型立體結構，而且發菜多糖的抗腫瘤活性也與其β-螺旋型的立體結構特征有關。對于高級結構，通常采用核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）、原子力顯微鏡（Atomic Force Microscope，AFM）等進行測定。其中，利用AFM可進行多糖分子表面形貌的觀察，用于觀察發菜多糖的三維結構[31]。

表1 發菜多糖的單糖組成及分子量Table 1 Monosaccharide composition and molecular weight of Nostoc flagelliforme polysaccharides

2 發菜多糖的生物合成研究進展

在我國，發菜主要分布于西北地區，且主要生長在干旱和半干旱區域[37]，具有防風固沙的作用，是沙漠地區的主要生物固氮資源和生態系統的重要維護者。研究表明，發菜生長環境的生態因子很有特性，光照條件、溫度、營養物質等因素均會影響發菜的生長[37-38]。而發菜多糖作為發菜生長代謝過程中分泌的一種重要抗性物質，其產量也會隨環境因素改變而發生變化[39]。盡管發菜對輻射、干旱等有很強的抗逆性，但在自然條件下生長極為緩慢，年生長率不高于10%[40]。再加上為獲取經濟利益而對發菜的過度開采，使得發菜的自然資源越來越少，無法滿足市場需求。因此，為了提高發菜多糖的產量，研究者采用多種人工培養方式，對發菜多糖合成的影響因素及生物合成機制進行了研究，并取得了一定的進展。

2.1 發菜多糖合成的影響因素

2.1.1 溫度 溫度作為發菜生命活動的一個重要限制因子，能夠直接影響發菜細胞的生長代謝過程，從而影響多糖的合成[39]。畢永紅等[39]和于海峰等[41]在研究中發現，發菜細胞的生長速率受溫度變化的影響極大，同時，溫度對發菜胞外多糖的合成和分泌量也有顯著影響，且高溫和低溫條件均不利于細胞的生長，但能夠提高單位質量發菜多糖的產量。Yu等[42]發現發菜細胞在25 ℃條件下生長良好，但相對較低和較高的溫度條件更有利于發菜多糖的積累。

2.1.2 光照條件

2.1.2.1 光照強度 在發菜培養過程中，光照強度能夠直接影響其光合作用，從而影響發菜的生物量和多糖合成[43-45]。郭偉[43]研究不同光照強度對發菜細胞的生長和發菜多糖產量的影響，結果表明，光照強度的增加有利于發菜細胞的生長和發菜多糖的合成，且將光強設置為60 μmol·m-2·s-1時，發菜多糖的產量最高，為0.7 mg/L。

2.1.2.2 光照周期 光照周期的變化通過影響細胞對營養物質的吸收和細胞內有機物的代謝等來影響胞外多糖的合成[44]。郭偉[43]通過研究不同光照周期對發菜細胞的生長和發菜多糖產量的影響發現，連續光照更有利于發菜細胞生長速率的提高和多糖的積累。

2.1.2.3 光質 不同種類微藻對不同光質的敏感程度不同，使得合成和分泌的多糖量也不同，例如，研究發現螺旋藻（Spirulina platensis）在綠光條件下多糖產量最高，在其他光照條件下產量相對較少[46]，而對于發菜，Han等[47-48]在研究不同種類光源對發菜多糖合成的影響時發現，相對于白色熒光，發菜細胞在紅光、藍光和紅藍混合光三種條件下能產生更多的發菜胞外多糖。

2.1.3 主要營養物

2.1.3.1 碳源 發菜是一種光合自養型生物，自然條件下可以以大氣中的CO2和碳酸鹽為碳源[49]。研究發現，發菜還可在異養條件下生長，即在無光照的環境中，發菜可通過分解代謝培養基中外加的葡萄糖來滿足其生長活動所需[49]。Yu[50]在BG-11培養基中分別添加了四種不同的碳源，即果糖、葡萄糖、木糖和蔗糖，且通過比較發現，當發菜處于只有葡萄糖碳源時，且同時添加了乙酸鹽的條件下時，細胞生長量和多糖產量均顯著提高。此外，韓培培等[49]研究發現，將葡萄糖設為發菜細胞培養基中的唯一碳源，并采用異養流加的培養方法，能夠有效提高發菜細胞的生長量和多糖的產量。

2.1.3.2 氮源 氮元素是藻類生長代謝所需的重要營養因子，不同種類和濃度的氮源會影響藻類蛋白質、多糖等物質的合成[51]。于海峰等[41]在探究不同氮鹽條件對發菜胞外多糖累積的影響時發現，硝酸鈉較硫酸銨和尿素更有利于發菜細胞的生長和胞外多糖的合成，且提高培養基中硝酸鈉的濃度可使發菜多糖的產量增加，但在硝酸鈉的最佳濃度（2.5 g/L）條件下，多糖的產量與無氮條件下基本一致。湯俊等[51]也通過研究發現，氮源的缺乏雖然不利于細胞的生長，但會在一定程度上促進胞外多糖的合成。畢永紅等[39]通過對照試驗卻發現，氮元素的缺乏會導致發菜胞外多糖的合成和分泌量下降。總之，盡管發菜具有一定的固氮能力，也能在氮源缺乏的條件下通過促進細胞胞外多糖的分泌實現自我保護，但從長遠的細胞培養角度考慮，適宜、足夠的氮源對于細胞的生長、代謝是必需的。

2.1.3.3 磷源 磷元素同樣是微藻生長代謝所需的一種營養成分，一定濃度的磷源有利于細胞的生長和胞外多糖的合成[39]。Yu[50]通過研究發現，盡管磷酸鹽對特定細胞胞外多糖的產量影響很小，但在BG-11培養基中加入KH2PO4時，發菜細胞的生長速度和胞外多糖的積累量均有所提高。

2.1.3.4 其他因素 采用不同的人工培養方式培養發菜，其細胞的生長和多糖的合成會受到不同因素的影響。目前，發菜的人工培養按照培養基形式的不同可分為液體培養和固體培養[6]。對于液體培養，除了以上提到的溫度、光照、碳源和氮源外，培養基的pH[42]、攪拌速率[52]等其他因素也會影響發菜的細胞生長和胞外多糖的合成[53]；對于固體培養，除了營養成分、溫度等因素外，固體基質的材料、濕潤性等因素也會對發菜多糖的合成和分泌產生影響[54-56]。

2.2 發菜多糖的生物合成機制

發菜多糖的合成是由多種因子共同參與完成的[57]，其合成機制較為復雜。因此，對發菜多糖的生物合成途徑、相關酶和基因等的研究對于其合成機制的全面揭示具有重要作用。

2.2.1 生物合成途徑 研究表明，盡管不同種類多糖的結構形式有差異，但其合成過程幾乎相同[58]，主要包含前體核苷酸糖的合成、糖重復單元的組裝延伸和聚合、多糖的修飾和輸出三步[6]。

當細胞將培養基中的碳源物質吸收至體內后，能通過多條代謝途徑生成能量ATP和多種前體物質等供細胞生長代謝利用[59]。其中，細胞在代謝過程中對于葡萄糖-6-磷酸的利用量很大，且利用其生成的各種核苷酸糖，經活化后可作為前體物質參與合成細胞胞外多糖[6]。通常，糖核苷酸供體在糖基轉移酶的作用下能與細胞膜上的受體物質結合，形成Und-PP-己糖，再在多種特異性糖基轉移酶的作用下完成對糖重復單元的組裝過程[6]。其中，糖基轉移酶既是多糖組裝過程中的一個關鍵酶，同時也是整個多糖合成過程中的關鍵酶，目前已經在多種生物體內發現了大量不同種類的糖基轉移酶，而且相關的研究還在進行當中。李歐[59]通過分析發現了Paenibacillus elgiiB69中的六個糖基轉移酶基因，并確定了這六種糖基轉移酶各自的催化功能，為多糖生物合成機制的進一步研究提供了基礎。

組裝后，重復單元開始進行延伸和聚合。在大多數胞外多糖的合成過程中，糖重復單元的延伸和聚合都是最關鍵的一個步驟[58]，其按機制可分為Wzy途徑、合酶途徑以及ABC-轉運蛋白途徑[6]。但是大多數為Wzy途徑[59]，即Und-p-p-重復單元在Wzy聚合酶的作用下聚合形成長鏈多糖后，便會從與其相連的載體上按一定順序轉移到新的Und-p-p-重復單元上，再進行聚合。而且在Wzy途徑中，多糖的運輸是在Wzx、Wzy等酶的共同作用下完成的。

2.2.2 生物合成途徑的相關酶和基因的研究 研究表明，高鹽度[60]、高光強[39]等逆境條件能夠刺激發菜細胞產生和分泌胞外多糖，甚至能使得發菜細胞通過改變多糖的單糖組成來抵抗逆境脅迫[61-62]。隨著基因工程等技術的發展，一些研究者為了探究逆境條件下發菜多糖產量提高的內在調節機制，改變了發菜細胞的培養條件來刺激多糖的產生，并與正常條件下的發菜樣品進行比較，再經轉錄組學和蛋白質組學等分析，從而篩選出與發菜多糖合成相關的差異表達基因或蛋白，分析這些差異表達基因和蛋白質對發菜多糖合成調控的作用對于發菜多糖合成機制的進一步研究具有十分重要作用[6]。

陳雪峰課題組的前期相關研究表明，在鹽脅迫條件下時，發菜細胞通過提高胞外多糖的分泌量來抵御高鹽離子滲入和水分滲出，并保護細胞[5,60]。據此，范華[6]、陳雪峰等[57]在研究中發現鹽脅迫條件下糖基轉移酶基因轉錄水平提高，促進了發菜多糖前體物質的合成，從分子層面證明了鹽脅迫下發菜胞外多糖產量的增加。范華[6]分別對鹽脅迫條件和正常培養條件下的發菜進行了轉錄組學分析，共篩選出了五種基因，分別為多糖輸出蛋白基因（PEP）、GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因（GMD）和三種糖基轉移酶相關基因（GT1、GT2、GT3），再利用基因工程技術對這五個基因進行克隆與表達，為發菜多糖合成機制的繼續研究提供了一定的理論基礎。

Han等[47-48]研究發現，相對于白色熒光，發菜細胞在紅光、藍光和紅藍混合光三種條件下能產生更多的胞外多糖，并采用蛋白質組學的方法獲得大量差異表達蛋白。對參與多糖合成的差異表達蛋白分析后發現，三種光照條件下多糖合成的調節機制相同，即通過促進糖核苷酸的合成來促進多糖的產生[63]。而且轉錄組學等分析結果表明，這三種光照條件下的糖核苷酸酶和糖基轉移酶相關基因的轉錄水平均有所提高，故說明發菜細胞在這三種條件下通過促進糖核苷酸和糖重復單元的合成來促進多糖的產生[64]。

目前，發菜細胞的抗逆境響應機制和多糖的合成機制還在進一步研究中。全面了解發菜多糖合成相關的酶和基因有助于構建高產多糖的發菜藻種，從而實現發菜多糖的大規模批量生產，以滿足消費者不斷增長的食用、醫用等需求[63]。

3 發菜多糖的生物活性

近年來的多項研究表明，發菜多糖具有抗氧化、抑菌抗炎、抗病毒、抗腫瘤以及免疫調節等多種活性功能。因此，發菜多糖在食品、醫藥等領域逐漸被開發、應用，有著良好的發展前景[33]。

3.1 抗氧化

正常條件下，機體能夠使得自由基的產生與清除過程維持在一種動態平衡狀態中，但是一旦當機體遇到有害刺激時，這種平衡狀態就會被破壞，使得自由基增多，便會對機體造成傷害甚至導致多種疾病出現，例如引起炎癥、形成腫瘤等[11]。多項研究發現，發菜多糖可以有效清除多種自由基，具有較好的體外抗氧化活性。湯俊等[65]就發菜多糖、葛仙米多糖和地木耳多糖對三種不同自由基的清除能力大小分別進行了研究。結果表明，三種多糖對超氧陰離子自由基和羥自由基的清除作用均較明顯，但是對DPPH自由基的清除作用均不明顯，其中發菜多糖對羥自由基的清除效果較其他兩種多糖是最強的，清除率最高為74.3%。陳雪峰等[66]分別研究了發菜的胞外多糖和莢膜多糖的抗氧化性。通過對比發現，超氧陰離子自由基、DPPH和羥自由基均能被發菜胞外多糖與莢膜多糖有效清除，而且胞外多糖較莢膜多糖的清除能力更強。研究還發現，野生型發菜的胞外多糖與人工液體培養的發菜多糖純化物相比抗氧化性更強，這可能與發菜多糖的空間結構在經過分離、純化等操作后發生了改變有關，而且純化后的發菜多糖失去了原來不同多糖化合物之間的協同作用，因此使得抗氧化活性降低[67]。目前對發菜多糖體外抗氧化的研究較多，而對發菜多糖體內抗氧化的研究還較少。符宏磊等[68]利用小鼠實驗，通過檢測小鼠血清中的CAT、SOD等酶類的活性來評價發菜多糖的體內抗氧化性，研究發現高劑量的野生發菜多糖與低劑量的人工培養發菜多糖均能顯著提高CAT和SOD的活性，說明發菜多糖可通過增強體內的抗氧化系統來發揮其抗氧化作用。

3.2 免疫調節

近年來研究發現，發菜多糖能夠提高免疫細胞和免疫器官的功能，因此，對體內、體外免疫均具有一定的調節作用[69]。

3.2.1 體外免疫調節 脾臟作為機體的一大重要器官，能夠直接反映出機體免疫功能的好壞。因此，體外試驗經常通過檢測脾臟中脾淋巴細胞的體外增殖、轉化活性來評價機體免疫水平的高低，故可作為體外免疫活性的評價指標[70]。杜潔[70]通過研究發現，發菜多糖在一定范圍內能夠作用于小鼠的脾淋巴細胞，從而提高其體外免疫功能。朱蓓茹[69]將發菜多糖純化物進行了硫酸化修飾和硒化修飾，且脾淋巴細胞增殖指數等評價指標顯示，分子修飾后發菜多糖的體外免疫活性較分子修飾前有所提高，且硫酸化修飾的發菜多糖較硒化修飾多糖而言，免疫調節活性更強。

3.2.2 體內免疫調節 體內免疫調節包括特異性和非特異性免疫，是免疫系統所包含的脾臟、胸腺等各個環節相互配合的過程。體內免疫調節過程中的每一個環節都對免疫調節和維持機體健康有重要作用[71]。且胸腺和脾臟能夠直接影響機體免疫功能的好壞，因此，可以利用胸腺指數和脾臟指數來評價機體免疫能力的好壞[69]。杜潔[70]經過研究發現，一定濃度的發菜多糖能夠顯著提高小鼠的脾臟指數和胸腺指數，說明發菜多糖能在一定程度上提高機體的免疫功能。侯茂霞等[72]研究發現，發菜多糖對小鼠特異性免疫功能的提高沒有顯著作用，但可通過作用于非特異性免疫細胞來間接提升小鼠的免疫能力。

3.3 抑菌抗炎

目前，已經有多種藻類多糖被證明具有抑菌性和抗炎作用[73]。杜潔[70]和郭金英等[73]研究發現，發菜多糖能在一定濃度范圍內對沙門氏菌、大腸桿菌以及紅曲霉等多種微生物菌種的活性起到抑制作用。此外，研究發現，發菜多糖能夠對由二甲苯和角叉菜膠引起的小鼠耳部和足部炎癥起到一定的減緩作用[73]。目前，對發菜多糖抗炎作用的相關研究相對較少，還在進一步的研究當中。

3.4 抗病毒

研究表明，發菜多糖具有一定的抗病毒性，能夠通過阻斷病毒對宿主細胞吸附的過程，從而保護宿主細胞避免受到病毒的攻擊。Kenji等[32]發現分離純化得到的發菜多糖能阻止HSV-1、HSV-2和甲型流感病毒等包膜病毒與細胞的識別和吸附，起到較強的抗病毒作用。而且盡管發菜多糖不能阻斷已經結合在宿主細胞上的病毒的滲透[74]，但在病毒對宿主細胞作用的初期，病毒與細胞的結合過程能夠被發菜多糖阻斷，從而降低細胞被感染的概率。此外，由于該發菜多糖不具有抗凝血酶活性，因而不會對細胞產生副作用[32]。因此，發菜多糖將來可作為一種有效的抗病毒藥物被開發利用。

3.5 抗腫瘤

發菜多糖作為一種新型生物活性多糖，具有一定的體外腫瘤抑制活性[75]。蘇振宏等[76]研究發現，發菜原植體和細胞產生的胞外多糖對人肝癌細胞HepG2都具有抑制作用，而且在作用過程中Caspase-3酶活性明顯得到了提髙，由此可說明發菜多糖很可能是通過使線粒體發生凋亡而達到抑制腫瘤細胞活性的目的的[76]。路苗[60]在探究鹽脅迫條件對發菜胞外多糖抗腫瘤活性的影響時，考慮到胞外多糖主要在人體腸道中發揮功能的特點，選擇了人結腸癌HT-29和LoVo細胞進行實驗，結果表明，鹽脅迫和正常培養條件下的發菜胞外多糖都能有效阻止腫瘤細胞的增殖過程，且鹽脅迫條件較正常條件的發菜多糖作用更強。

4 展望

近年來，發菜多糖抗氧化、抗病毒和抑菌抗炎等生物活性逐漸被發現，在食品、藥品等領域具有良好的開發應用前景。雖然國內外研究者已經對發菜多糖進行了一系列研究，但還存在一些問題，例如：發菜多糖的提取率較低；不同培養條件下發菜多糖的組成各異，生物活性也有一定的差異；對于發菜多糖的合成機制還未完全了解。因此，還需要通過結合新型技術等方式提高發菜多糖的提取率，深入研究發菜多糖結構與功能活性的關系，探究發菜多糖降血糖血脂以及調節腸道菌群的功能，并繼續篩選與發菜多糖合成相關的蛋白質和基因，不斷了解發菜多糖的整個代謝調控機制，為發菜多糖在食品、化妝品以及醫藥等方面的開發應用提供更加全面、系統的理論基礎。