植物多肽類胰蛋白酶抑制劑降糖功效研究進展

王 蕾，王雅馨，石亞偉

（山西大學生物技術研究所，化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西太原 030006）

胰蛋白酶抑制劑（Trypsin inhibitor，TI）通常是指一類具有抑制胰蛋白酶活性的物質，它能與胰腺分泌的絲氨酸蛋白酶系（如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等）發生不可逆的反應，進而降低生物體對蛋白質的消化、吸收，調節生物體內許多重要的生命活動。胰蛋白酶抑制劑來源廣泛，普遍存在于動植物及微生物中。目前主要從豆科植物和動物肝臟中提取，在大多數植物貯藏器官中，其含量特別豐富，最高可達總蛋白的10%左右。迄今為止，已有數百種天然胰蛋白酶抑制劑相繼得到分離和鑒定，并且有多種抑制劑被證明具有抗癌[1]、抗炎[2-3]、抗蟲[4-5]及治療心血管疾病[6]、人類獲得性免疫缺陷癥[7]等惡性疾病的潛在應用價值，相關的作用機制被廣泛研究，但是對其在糖尿病治療中的功效報道較少。

早在上世紀70年代，就有報道稱大豆中微量的胰蛋白酶抑制劑對于糖尿病治療、調節胰島素失調有一定效果[8-10]。隨后人們從大豆、銀杏、永川豆豉、紫花蕓豆、亞麻以及智利當地特有的一種豆科植物Geoffroea decorticansz中相繼提取到了具有降糖活性的胰蛋白酶酶抑制劑，但其降糖功效僅在動物實驗得以證實，缺乏相關降糖的分子靶標、作用機制等的研究。

本文將介紹胰蛋白酶抑制劑在降糖方面的作用及其研究現狀，重點分析分子靶標是α-葡萄糖苷酶的降糖機制，并對胰蛋白酶抑制劑降糖功效的應用與開發提出展望，為今后深入研究胰蛋白酶抑制劑的降糖機理提供理論參考。

1 胰蛋白酶抑制劑的分類

胰蛋白酶抑制劑主要作用于分子內活性部位是賴氨酸的蛋白酶，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑，能與胰蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）的必需基團結合使其失活，從而抑制胰蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）與底物結合。通常，人們根據胰蛋白酶抑制劑的相對分子質量、反應位點數以及半胱氨酸含量等差異，可將其分為五大主要類型：Kunitz型、Bowman-Birk型、Kazal型、PotatoⅠ及Potato Ⅱ型，其中對Kunitz、Bowman-Birk及PotatoⅠ/Ⅱ型的研究較多（見表1）。此外，還可根據其等電點的不同，將胰蛋白酶抑制劑分為酸性、中性、堿性這3種類型。

表1 胰蛋白酶抑制劑的分類及其特征Table 1 Classification and characteristics of trypsin inhibitors

1.1 Kunitz型胰蛋白酶抑制劑

Kunitz型胰蛋白酶抑制劑（Kunitz trypsin inhibitor，KTI）只含一個功能性抑制域和一個反應位點，只能抑制胰蛋白酶活性。KTI的三級結構較為保守，大多由一個明顯的疏水核心、兩對或三對高度保守的二硫鍵橋、三鏈β-折疊和一個N端310螺旋及一個C端α-螺旋組成（植物KTI的三維結構中不含有α-螺旋）[11-12]。

1.2 Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑

Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑（Bowman-Birk trypsin inhibitor，BBI）對胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶及彈性蛋白酶均可以發生抑制作用，不具有抑制專一性。BBI分子內富含半胱氨酸，可形成多個鏈內或鏈間二硫鍵，易折疊形成復雜的高級結構同時加上亞基間極性相互作用，使BBI具有較好的穩定性[13]。

1.3 Potato Ⅰ型和Potato Ⅱ型胰蛋白酶抑制劑

Potato Ⅰ型（PI-I）和Potato Ⅱ型（PI-II）胰蛋白酶抑制劑是一類具有較高熱穩定性和酸堿穩定性的蛋白酶抑制劑。其中PI-I只有一個活性中心，主要抑制胰蛋白酶活性，而對胰凝乳蛋白酶的抑制作用較弱。PI-II由兩個重復序列構成，包含兩個活性中心，能同時抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的活性[14]。

2 胰蛋白酶抑制劑的降糖作用及其分子機制

雖然植物蛋白類胰蛋白酶抑制劑可能具有降糖活性早有報道，但對其降糖功效的研究近些年才被人們廣泛關注。豆豉胰蛋白酶抑制劑可明顯降低糖尿病小鼠血糖[15]。大豆胰蛋白酶抑制劑可以降低糖尿病模型小鼠血糖和血清甘油三酯水平，可改善其肝腎器官的病變程度[16]，能夠促進大腸對胰島素的吸收[17]。紫花蕓豆胰蛋白酶抑制劑可抑制四氧嘧啶誘導的糖尿病小鼠血糖升高，同時降低血清總膽固醇，但對高密度脂蛋白膽固醇和三酰甘油的效果不明顯[18-19]。銀杏種子中胰蛋白酶抑制劑可以有效的降低糖尿病模型大鼠血糖、血清甘油三酯、血清總膽固醇，同時升高高密度脂蛋白膽固醇[20]。花生中提取的一種胰蛋白酶抑制劑AHTI可以顯著降低大鼠空腹血糖，同時能夠控制體重增加和食物攝入量[21]。羅望子胰蛋白酶抑制劑TTI可以降低大鼠空腹血糖以及胰島素抵抗指數，同時升高高密度脂蛋白膽固醇[22]。此外，亞麻胰蛋白酶抑制劑LUTI以及豆科植物Geoffroea decorticansz中的一種胰蛋白酶抑制劑GdTI也具有一定的降糖功效[23-25]。

2.1 具有降糖活性的胰蛋白酶抑制劑的類型

隨著對胰蛋白酶抑制劑降糖作用研究的深入，研究人員發現其降糖功效并不具有普遍性。通過對目前有文獻報道明確具有降糖活性且已知的胰蛋白酶抑制劑序列分析，可知亞麻胰蛋白酶抑制劑LUTI屬于Potato I型胰蛋白酶抑制劑，pI值為9.55[23]；大豆胰蛋白酶抑制劑SBTI和羅望子胰蛋白酶抑制劑TTI屬于Kunitz型胰蛋白酶抑制劑，其pI值分別為8.37和5.41[16,22]（見圖1）。而針對近期報道的一種豆科植物Geoffroea decorticansz中的胰蛋白酶抑制劑GdTI的研究發現，其已知的一段酶解序列與大豆中的BBI同源性較高，但沒有完整的氨基酸序列信息，屬于Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑的類型。從目前文獻資料來看，各種類型的胰蛋白酶抑制劑均有可能具有降糖作用，其共性在于具有胰蛋白酶的抑制活性，但如何發揮其在動物體內的降糖作用，從一級結構序列很難看出其他共同特點（序列比對使用Genetyx和GeneDoc軟件完成）。

圖1 LUTI, SBTI和TTI的同源序列比對Fig.1 Alignment of the amino acid sequence of LUTI, SBTI and TTI

2.2 胰蛋白酶抑制劑降糖作用的分子機制

目前，已知報道的降糖藥物作用機制如圖2所示，主要包括：腸道內微生物菌群的調控及延緩腸道內葡萄糖的吸收（糖苷酶抑制劑等）[26-27]；通過提高PPARγ表達量和AMPK活性等增加靶細胞對胰島素的敏感性（胰島素增敏劑等）[28-29]；促進胰島β細胞分泌胰島素（磺脲類、格列奈、GLP-1類似物等）[30]；增強葡萄糖轉運蛋白等的表達以促進葡萄糖吸收，增加外周組織攝取和利用葡萄糖（雙胍類）[31]。此外，還可以通過降低炎癥因子TNF-α、IL-4、IL-17等表達量減少炎癥反應以降低線粒體氧化應激損傷[32-33]，提高胰島素與受體的親和力以增加胰島素對血糖的清除作用[34]，降低胰島β細胞及胰島組織損傷[35]，抑制肝糖異生和糖原分解、降低肝糖輸出、減少糖原生成[36]等途徑來達到降糖的目的。

圖2 體內改善葡萄糖穩態的相關機制匯總Fig.2 Summary of potential mechanisms to improved glucose homeostasis

胰蛋白酶抑制劑雖已經證實具有降糖功效，但是其具體的降糖方式、作用靶標并不十分清楚。目前研究較為集中的分子靶標是α-葡萄糖苷酶，通過抑制其活性來達到降糖的功效，此外在抑制糖異生、促進胰島素分泌、免疫調控等方面也有一定的報道，可以說胰蛋白酶抑制劑的降糖功效可能是一種或多種機制共同作用的效果（如表2）。

表2 胰蛋白酶抑制劑的降糖機制Table 2 Hypoglycemic mechanism of trypsin inhibitors which has been reported

2.2.1 分子靶標是α-葡萄糖苷酶的胰蛋白酶抑制劑

在以往降糖藥物的研究中，α-葡萄糖苷酶抑制劑一直都是降低餐后血糖的一線藥物，其能夠通過競爭性抑制或可逆性抑制位于小腸刷狀細胞表面的α-葡萄糖苷酶活性、延緩總體碳水化合物的消化時間、調節餐后胃腸激素和腸道菌群等方式有效控制餐后血糖的升高，產生較為理想的降糖效果[38]。天然植物是α-葡萄糖苷酶抑制劑的主要來源，但是目前絕大多數研究主要集中在黃酮類[39-40]、皂苷類[41]、三萜類[42]、奎寧酸類[43]、酚類[44]、苯乙胺類[45]等化合物中，而對于植物蛋白類的研究較少。Ye等[46]從白色扁豆中分離得到一種28 kDa的蛋白dolichin，通過抑制α-葡萄糖苷酶的活性來調節血糖水平。大花田青中分離的蛋白SGF60/90以及豇豆中的一種抗病毒蛋白unguilin對α-葡萄糖苷酶具有顯著的抑制作用[47-48]。此外，人們還從大麻種子[49]、苦瓜[50]、白蛋白[51]、南瓜子[52]、大豆[53]、牛奶[54]等提取了不同種類的降糖多肽，研究表明其調節血糖的分子靶標正是α-葡萄糖苷酶。近期，Wang等[24]從胡麻的籽粕分離到一個分子量為8 kDa的小分子多肽，經質譜鑒定該多肽為亞麻胰蛋白酶抑制劑LUTI，其可與α-葡萄糖苷酶在體外緊密結合，競爭性抑制α-葡萄糖苷酶活性，其IC50值為113.92 μmol/L（阿卡波糖為592.35 μmol/L），且在細胞水平上能夠增加葡萄糖的消耗和乳酸的生成，從而達到降糖的功效。Cotabarren等[25]從智利當地特有的一類豆科植物Geoffroea decorticansz中分離得到一種胰蛋白酶抑制劑GdTI，對α-葡萄糖苷酶具有很強的抑制活性（IC50=0.18 μmol/L），同時該抑制劑具有良好的抗凝血功能，這為其作為調控血糖的潛在藥物提供了一定的可能性。

此外，研究人員在以α-葡萄糖苷酶為分子靶標的研究中發現，胡蘿卜中存在一種堿性胰蛋白酶抑制劑DCTI能夠抑制α-葡萄糖苷酶活性（其半抑制常數稍低于GdTI），但是其并不具有胰蛋白酶抑制活性（未發表數據）。通過序列分析可知這種胰蛋白酶抑制劑屬于Potato I型胰蛋白酶抑制劑，且與LUTI的同源性為69.84%（如圖3）。但同屬Potato I型的甜蕎麥胰蛋白酶抑制劑BTI（Fagopyrum esculentum，common buckwheat）則不具有α-葡萄糖苷酶抑制活性[24]。

圖3 Potato I型胰蛋白酶抑制劑的同源序列比對Fig.3 Alignment of the amino acid sequence of Potato I trypsin inhibitors

2.2.2 分子靶標是非α-葡萄糖苷酶的胰蛋白酶抑制劑 胰蛋白酶抑制劑的降糖機制，除通過抑制α-葡萄糖苷酶活性外，其是否會影響到其他的降糖靶標（如葡萄糖轉運蛋白、胰島素分泌、胰島素敏感性、胰島素抵抗、炎癥反應、糖代謝等）還不十分清楚（如圖2），人們對于胰蛋白酶抑制劑降糖作用機理的認識還比較有限。豆豉胰蛋白酶抑制劑對四氧嘧啶糖尿病模型小鼠胰島組織有明顯的修復作用，推測其可能是通過保護或修復胰島β細胞及胰島組織，促進胰島素分泌或釋放從而達到降糖的目的，但其對α-葡萄糖苷酶無抑制活性，同時也不影響糖代謝過程[15]。王靜等[18]推測紫花蕓豆胰蛋白酶抑制劑的降糖機制可能是通過其對胰腺產生作用，促進胰島素分泌釋放，從而增加各個組織對葡萄糖的攝取和利用。而對大豆胰蛋白酶抑制劑SBTI的研究發現，其可以保護四氧嘧啶糖尿病模型小鼠的肝細胞、改善其糖耐量、抑制糖異生，促進肝糖原合成，進而使血糖濃度下降。陳金銘等[20]發現銀杏種子中胰蛋白酶抑制劑可以通過有效的降低血清中細胞免疫因子TNFα、IL-4、IL-17和免疫球蛋白IgA水平，升高高密度脂蛋白膽固醇，免疫球蛋白IgG、IgM水平，對免疫系統及補體系統有一定的免疫調節作用，達到治療糖尿病目的。Serquiz等[21]發現花生胰蛋白酶抑制劑AHTI能夠增加飽腹感，促進人膽囊收縮素/腸促胰酶肽（CCK）的生成，促進胰島素分泌，進而降低空腹血糖。羅望子胰蛋白酶抑制劑TTI很可能通過抑制脂肪組織分泌的激素作用從而降低空腹血糖，或者作為一種激素信號與胰島素受體結合，參與葡萄糖的吸收和釋放[22,55-56]。

3 展望

胰蛋白酶抑制劑通常被認為是一種抗營養因子，在動物養殖及人類食品的應用中都需要經特殊處理使其失活，才能有助營養的吸收和利用。由于天然植物來源的胰蛋白酶抑制劑存在范圍廣、穩定性好，與一般小分子藥物相比毒副作用小、開發成本低且對消化道內的蛋白酶具有天然的抵抗能力等優點，其在降糖功能性食品開發以及口服藥物糖尿病的預防、治療中有巨大的潛在效用，因此，開展對不同類型胰蛋白酶抑制劑的降糖活性及其降糖機理的研究就顯得尤為重要。一直以來，人們對胰蛋白酶抑制劑的研究主要聚焦于抗病毒、抗癌等多種功效上，而對其降糖功效的研究雖在體外動物實驗得以證實，但其具體的降糖效果及降糖機制還不明確，關于胰蛋白酶抑制劑是否能作為一種藥品治療糖尿病，或是作為一種功能性食品、保健品預防糖尿病的研究還需要繼續深入。未來研究需要側重在以下兩方面：一是胰蛋白酶抑制劑的降糖功效是否具有普遍性，從結構和某些生化特性上明確具有降糖活性的胰蛋白酶抑制劑類型，為找尋更多的此類藥物提供某種可能性；二是胰蛋白酶抑制劑的降糖機制具體是什么，通過對其降糖機理的挖掘，可以進一步運用生物化學、分子生物學等手段提高其降糖效果，減少藥物的不良反應，對于應用其防治糖尿病和提高患者生存質量方面具有重要的現實意義。