亞油酸水合酶生物合成微生物源羥基不飽和脂肪酸的研究進展

彭舒悅，梁暖意，張延鎮，郭前婉，王 琪，趙 萌, ，Michael G. G?nzle,

（1.發酵工程教育部重點實驗室，湖北省食品膠體國際科技合作基地，湖北省工業微生物重點實驗室，湖北工業大學，湖北武漢 430068；2.農業、食品與營養科學系，阿爾伯塔大學，加拿大埃德蒙頓 T6G 2P5）

羥基不飽和脂肪酸（Hydroxy unsaturated fatty acids, HUFA）是一類具有羥基及不飽和鍵結構的特殊脂肪酸，主要有馬桑酸（13-羥基-9，11-十八碳二烯酸）、蓖麻油酸（12-羥基-9-十八碳烯酸）、10-羥基-12-十八碳烯酸（10-HOE）、13-羥基-9-十八碳烯酸（13-HOE）等。特定結構的HUFA具有真菌抑制[1-2]、細菌抑制[3]、抗炎[4-5]、抗癌[6-7]等功能特性，其在生物醫藥領域應用潛力巨大，近年來，其合成方法及功能特性受到關注。

HUFA的合成途徑主要包括化學合成、植物提取、生物轉化（酶轉化或細胞轉化）三種方法?；瘜W合成法一般缺乏特異性，會生成目標產物HUFA的一系列異構化合物，通常需要進行較復雜的下游純化[8-9]。植物提取法可用于從植物本身油脂成分中分離HUFA，該方法較為簡單、產率高、特異性強，但該法受限于特定的植物來源以及HUFA的結構種類（如馬桑酸和蓖麻油酸）[10]；或從植物受致病菌侵染時產生的防御反應物質中提取，這些防御反應物質成分一般較為復雜[11]。生物轉化法產物較為簡單、反應特異性強、對環境友好，已成為HUFA制備的主流途徑。

加拿大阿爾伯塔大學G?nzle團隊深入探索了多種HUFA的相關抑菌特性及應用[10,12]，發現10-HOE及13-HOE在抑制真菌效果上表現優異，作為食品中的天然防腐劑具有良好的發展潛能[1]。10-HOE、13-HOE是目前研究最多的兩種微生物源HUFA，可利用亞油酸水合酶通過生物轉化法催化亞油酸合成[13-14]。韓國建國大學Oh團隊[14-15]所報道的高效13-HOE的酶法合成及細胞合成，可使轉化率達79%。本文首先介紹了10-HOE及13-HOE這兩種典型HUFA的發展現狀及功能特性，對其在食品等方面的應用做出展望；然后概述了10-HOE及13-HOE生物轉化制備過程中起重要作用的亞油酸水合酶，總結其底物及結構特性、在HUFA轉化中應用的相關研究進展等。

1 微生物源HUFA概述

HUFA廣泛存在于自然界中，典型的HUFA主要有馬桑酸、蓖麻油酸、10-羥基-12-十八碳烯酸（10-HOE）、13-羥基-9-十八碳烯酸（13-HOE）等，其生產方式如表1所示。馬桑酸及蓖麻油酸合成方法多樣，目前均可進行高效制備[2,16-17]。7,10-二羥基-8-十八碳烯酸、7,10,12-三羥基-8-十八碳烯酸相關功能特性研究較少，且微生物合成步驟較為繁瑣[18]。10-HOE、13-HOE主要經腸道乳酸菌[19]、發酵制品微生物[1]等微生物直接合成，屬于典型的微生物源HUFA。與其它HUFA相比，10-HOE及13-HOE抑真菌性良好，具有抗炎、抗過敏等功能，在生物醫藥領域應用潛力大。且微生物法合成10-HOE及13-HOE具有產物合成效率高、副產物少等優點。

表1 不同羥基不飽和脂肪酸的生產方式Table 1 Preparation of different hydroxyl unsaturated fatty acids

1.1 10-HOE及13-HOE的結構及來源

1.1.1 10-羥基-12-十八碳烯酸（10-HOE） 10-羥基-12-十八碳烯酸（10-OH C18:1，10-HOE），分子式為C18H34O3，分子量為298.450，結構如圖1所示，其結構中包含一個12-位碳碳雙鍵和一個10-位羥基[1]。10-HOE首次發現于1983年，Takatori等[20]用氯仿/甲醇（2:1，v/v）提取死亡人體中的總脂，在5%鹽酸甲醇溶液中甲酯化，對收集的脂肪酸甲酯進行薄層色譜（TLC）、氣液色譜（GLC）和氣相色譜質譜（GCMS）檢測時，發現一種未知的脂肪酸甲酯，最終通過結構分析確定該脂肪酸為10-HOE，并指出亞油酸為10-HOE的合成底物。

圖1 10-HOE的分子結構Fig.1 Molecular structure of 10-HOE

隨后，有研究報道Streptococcus pyogenes[21]等野生菌具有將亞油酸合成10-HOE的能力。Bergamo等[22]、Miyamoto等[23]發現腸道菌群也可將膳食亞油酸轉化為10-HOE，并對腸道的免疫功能及穩態起到重要的調節作用。10-HOE不僅可由亞油酸作底物合成，與共軛亞油酸也有著密不可分的聯系。Kishino等[19]在對乳酸菌的研究中發現：10-HOE在積累到一定程度后轉化為10-氧-順式-12-十八烯酸、10-氧-反式-11-十八烯酸、10-羥基-反式-11-十八烯酸，最后合成共軛亞油酸，其合成途徑如圖2所示。2019年

圖2 10-HOE及共軛亞油酸的合成途徑Fig.2 Synthesis of 10-HOE and conjugated linoleic acid

Gao[24-25]進一步研究證實了雙歧桿菌中10-HOE可通過多組分酶系統轉化為共軛亞油酸，在亞油酸過量產生脅迫時，提供新的合成共軛亞油酸的途徑，同時10-HOE的含量與亞油酸水合酶的表達水平呈正相關。

1.1.2 13-羥基-9 -十八碳烯酸（13-HOE） 13-羥基-9 -十八碳烯酸（13-OH C18:1，13-HOE），分子式為C18H34O3，分子量為298.450，結構如圖3所示，其結構中包含一個9-位碳碳雙鍵和一個13-位羥基[1]。

圖3 13-HOE的分子結構Fig.3 Molecular structure of 13-HOE

1998年Hudson等[26]從哺乳期奶牛的新鮮糞便中分離出兩株Enterococcus faecalis，加入亞油酸進行培養后利用高效液相色譜法（HPLC）和GC/MS對產物進行鑒定，結果顯示亞油酸通過水合作用不僅可產生10-HOE，還首次利用細菌合成了13-HOE。該團隊繼續尋找亞油酸水化菌，從牛糞便中分離出Streptococcus bovis和S. bovisJB1，發現這兩個菌株可水化亞油酸且只生成13-HOE，其中利用S. bovis合成13-HOE的產率可達28%。

2003年Kishimoto等[27]對86株乳酸菌進行培養鑒定，發現有兩株Lactobacillus acidophilus和一株Pediococcus pentosaceus具有將亞油酸轉化合成13-HOE的能力，其中L. acidophilus13951的合成能力最強，并且該研究首次確定了13-HOE的立體結構為S型。2013年Takeuchi等[28]進一步篩選了300株乳酸菌，研究其對13-HOE的合成能力，結果發現大多數菌株可合成13-HOE，其中Pediococcussp.AKU 1080最具潛力，可特異性將2 mg/mL亞油酸轉化合成0.4 mg/mL的13-HOE。Chen等[13]采用10-亞油酸水合酶（linoleate 10-hydratase, 10-LHT）基因（lah）缺陷突變株Lactiplantibacillus plantarumTMA1.460Δlah，將底物亞油酸轉化成13-HOE，并成功提純13-HOE研究其抗真菌特性。13-HOE主要由含有亞油酸水合酶的菌株催化亞油酸轉化而來，且不同的亞油酸水合酶可合成不同的HUFA。

1.2 10-HOE、13-HOE的功能特性

1.2.1 抑真菌性 HUFA具有良好的真菌抑制特性，而在食品腐敗真菌中，HUFA抗真菌性主要針對的是霉菌而非酵母菌[12]，2013年加拿大阿爾伯塔大學G?nzle團隊首次在發酵面團中發現Levilactobacillus hammesii可轉化亞油酸生成10-HOE，同時證實，與傳統面包相比，用該發酵面團制備的面包貨架期延長了2～6 d以上，其真菌抑制效果可與商品化真菌抑制劑丙酸（添加量為4%）媲美[1,29]，且對面包的感官特性無不良影響。Quattrini等[30]認為HUFA在酸面團面包中的抗菌作用源于HUFA與醋酸等抗菌物質的協同作用。該團隊系統性研究了10-HOE、13-HOE、馬桑酸、蓖麻油酸等HUFA的真菌抑制特性。如表2所示，10-HOE、13-HOE、馬桑酸、蓖麻油酸等HUFA對A. niger和P. roqueforti的抑制最明顯，其MIC值均小于0.5 g/L。與HUFA相比，亞油酸、油酸不含羥基；12-羥基硬脂酸、9,12–二羥基硬脂酸不含不飽和鍵；硬脂酸中羥基及不飽和鍵都不具備，這五種物質的MIC均大于20 g/L，真菌抑制效果不明顯[1,13]。研究表明10-HOE、13-HOE的羥基及不飽和鍵是它們抗真菌特性的重要結構特征[1,10,13]；碳鏈中羥基的位置也對HUFA的抗真菌效果起到關鍵作用：羥基位于C9～C13位置的碳18HUFA抑制了霉菌P. roqueforti和A. niger生長，而羥基位于C2及C18位置的HUFA對霉菌抑制作用較小[12]。此外，其他乳酸菌來源的3-OH C10-12脂肪酸也被報道具有抗真菌作用[31]。HUFA所具有的廣泛抑真菌譜使其可作為一種新型天然防腐劑應用于食品中，目前部分研究探索了以HUFA為代表的脂肪酸氧化產物在植物抗病、抗致病真菌方面的功能[11,32]，雖未有文獻報道10-HOE和13-HOE在這方面的功能，但與其結構類似的馬桑酸、馬桑酸9-OH同系物及C18:3的HUFA同系物均在植物抗病毒中發揮了重要的作用。例如，研究[33-34]發現，轉基因水稻植株（transgenic rice（F78Ri））對稻瘟病菌Magnaporthe grisea有抗性，其C18:2脂肪酸到C18:3脂肪酸的轉化途徑受到抑制，該額外積累的C18:2脂肪酸轉化成馬桑酸等系列HUFA、其它脂肪酸氧化物和過氧化產物，這些積累的脂肪酸代謝產物均能抑制M.grisea的孢子萌發及生長。據報道，一些HUFA與產生這些HUFA的酶在不同的植物防御代謝途徑中均起到重要的作用，如羥基在脂肪酸碳鏈中部（13-OH及9-OH羥基脂肪酸）、羥基在脂肪酸碳鏈兩端（2-OH及w-OH脂肪酸）的HUFA[35]。這些與細菌源HOE結構極其類似的HUFA在植物抗病中有一定的應用前景，由此推測細菌源的10-HOE和13-HOE在植物防御方面可能有類似的調控作用，但該方面的研究及應用還沒有報道。

表2 典型脂肪酸的真菌抑制特性的比較Table 2 Comparison of fungal inhibition ability of typical fatty acids

大多數研究認為HUFA的抗真菌機制是由于其嵌入真菌細胞脂質雙分子層，而破壞了真菌細胞膜功能[12,31,36]。Sj?gren等[31]證明來源于L. plantarumMiLAB 14的四種3-羥基脂肪酸（3-羥基-5-十二碳烯酸、3-羥基十二烷酸、3-羥基四癸酸、3-羥基癸酸）可通過影響真菌的細胞膜結構，增加了膜的通透性，使細胞內電解質和蛋白質釋放，最終導致真菌細胞的解體。G?nzle團隊[12]則認為HUFA可能針對真菌細胞膜的特定區域或脂筏進行作用，而不改變整個膜的流動性；真菌對HUFA的敏感性可能與甾醇含量有關，耐HUFA的酵母（其MIC一般大于等于1 g/L）相對于HUFA敏感的霉菌（其MIC一般小于1 g/L）擁有更高的甾醇含量[10,12]。晏石娟等[37]研究了馬桑酸等脂氧素的抑制真菌機制，認為脂氧素通過調控真菌的G蛋白偶聯受體（GPCRs）活性而抑制曲霉屬真菌生長繁殖。10-HOE及13-HOE的真菌抑制機理目前仍處于探索階段，需要進一步研究其具體抑菌過程。

1.2.2 抗炎性 在腸道性炎癥中，腫瘤壞死因子是發病的關鍵促炎細胞因子，腫瘤壞死因子受體的阻斷已被證明能有效抑制小鼠結腸炎中的炎癥和細胞凋亡[38]，因此，腫瘤壞死因子受體的阻斷成為一個抑制腸道炎癥的有利手段。10-HOE是亞油酸的腸道微生物代謝物，Miyamoto等[23]發現G蛋白偶聯受體40在腸道屏障中起關鍵作用，而腸道微生物代謝產物10-HOE可作為一種新型內源性G蛋白偶聯受體40激動劑，通過不飽和雙鍵與受體結合，下調腫瘤壞死因子受體2的表達，改善了腸道屏障的損傷，從而達到一定的抗炎作用。Bergamo等[22]通過研究10-HOE對脂肪酸代謝物在抗原呈遞細胞成熟及促炎因子釋放過程的影響，證實了腸道源L. plantarumAKU 1009a在合成共軛亞油酸過程中產生的10-HOE與食品、藥品中的功能成分順9，反11-共軛亞油酸類似，可通過增強抗氧化和解毒防御的能力對免疫細胞進行調節，這可能是由于10-HOE降低了促炎因子的釋放而對腸道炎癥起到一定的抑制作用。

除了可抑制腸道炎癥，10-HOE對大腦炎癥有潛在的調節和控制作用。阿爾茨海默癥、帕金森綜合征、多發性硬化癥等神經退行性疾病的病理發生與大腦炎癥密切相關[39]。Ikeguchi等[40]認為抑制小膠質細胞（中樞神經系統的一種免疫細胞）的活性對神經退行性疾病可能是一個有利的治療方法，其研究發現酮醇和10-HOE可通過抑制胞外信號調節激酶磷酸化，從而抑制小膠質細胞一氧化氮合酶的表達及一氧化氮的產生，對大腦炎癥有望達到抑制及治療的作用。

另外，馬桑酸（13-hydroxyoctadecadienoic acid,或稱13-HODE和13-OH C18:2）及其異構體9-羥基十八碳二烯酸（9-HODE或稱9-OH C18:2）是一種與10-HOE及13-HOE結構類似的HUFA，其含量變化與很多炎癥都有較強相關性。有研究表明，這些HUFA在一定程度上參與了炎癥過程的調控[4,5,41]。與馬桑酸和9-羥基十八碳二烯酸結構類似，10-HOE和13-HOE有可能具有相應的調控作用，但該方面的研究仍有較多空白有待補充。

1.2.3 抗過敏性 Kaikiri等[42]通過對特異性皮炎模型鼠NC/Nga小鼠喂食含0.01%（W/W）10-HOE的AIN-93G飼料，測試其靜脈血樣中總IgE（免疫球蛋白E）水平、糞便中的IgA（免疫球蛋白A）和腸道菌群，分析小腸黏膜的皮膚淋巴細胞、皮膚切片組織，研究10-HOE對NC/Nga小鼠的抗過敏作用。結果顯示10-HOE可通過降低血清IgE、調節Th1/Th2平衡相關的細胞因子，誘導IgA的產生，而IgA可以抑制腸道抗原的免疫激活，從而改善了NC/Nga小鼠的過敏性皮炎的癥狀，同時還抑制了皮膚背部的肥大細胞浸潤（肥大細胞浸潤是過敏性炎癥的主要表現）。該研究表明，10-HOE有望作為一種新型功能性成分，具有預防過敏性皮炎等過敏性疾病的潛力。

2 亞油酸水合酶的研究進展

2.1 亞油酸水合酶概述

水合酶（EC 4.2.1.x）指催化雙鍵可逆水化反應的一類酶，常見的水合酶主要有乙炔水合酶（EC 4.2.1.112）、基輔酮水合酶（EC 4.2.1.95）、延胡索酸水合酶（EC 4.2.1.2）[43]等。水合酶在常用重組宿主中表達良好，通常對底物具有良好的活性，但目前大多水合酶具有輔酶因子依賴性[43]。

亞油酸水合酶（linoleate hydratase, LHT）最初稱為肌球蛋白交叉反應抗原（myosin-cross-reactive antigens，MCRA），是對亞油酸雙鍵位置具有特異性且不會發生反異構化反應的特異性水合酶，分子量約為67 kDa[44]，其特征在于它們可將脂肪酸雙鍵羥基化，其中氧原子來自水而不是分子氧[45]。亞油酸水合酶廣泛存在于革蘭氏陽性和陰性細菌中，1994年Kil等[21]首次在Streptococcus pyogenes中發現MCRA由一類廣泛存在于細菌中的蛋白質組成。研究證實MCRA具有脂肪酸水合酶的活性，并與Limosilactobacillus reuteriPYR8中的亞油酸異構酶具有高度的同源性[46]。亞油酸水合酶可歸類為依賴黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的雙鍵水合酶，屬于碳氧裂解酶，其中FAD不參與催化反應，但對蛋白質穩定性起作用[45]。

根據羥基位置的不同，亞油酸水合酶主要分為10-亞油酸水合酶（10-LHT）和13-亞油酸水合酶（13-LHT），其中10-LHT除對亞油酸具備活性外，也有催化油酸生成10-羥基硬脂酸的能力，也可稱為油酸水合酶（EC 4.2.1.53）[47]。2011年Kishino等[48]發現L.plantarumAKU 1009a含有10-LHT，且主要存在于細胞膜上。2013年Yang等[49]探索了四種分別來自Lacticaseibacillus rhamnosus、L. plantarum、L.acidophilus和B. animalissubsp.lactis的MCRA，發現它們均具備10-LHT的活性。2015年，Kim等[15]首次深入研究了10-LHT及13-LHT，結果顯示10-LHT對順-9雙鍵表現出較好的區域選擇性，對亞油酸及油酸都具有活性，可合成10-HOE和10-羥基硬脂酸；13-LHT則具有順-12雙鍵的特異性，可經過酶轉化合成13-HOE，且13-LHT蛋白是亞油酸特異性水合酶，不會發生反異構化反應。

2.2 亞油酸水合酶的底物特性和結構特性

亞油酸水合酶對不同的底物顯示不同的活性，均可特異性轉化為不同的羥基脂肪酸，但對亞油酸的活性最強。Kim等[15]研究了重組10-LHT和13-LHT酶促動力學，比較它們對不同底物的活性，通過動力學參數表明10-LHT對亞油酸及油酸均有一定的活性，10-LHT對亞油酸的催化效率（kcat/km）為5（1/mmol/L/min），高于對油酸的催化效率3.2（1/mmol/L/min）；13-LHT則對亞油酸表現出更高的催化效率，約為82（1/mmol/L/min），同時13-LHT對α-亞麻酸的及γ-亞麻酸的催化效率僅分別為9和13（1/mmol/L/min），由于對其他底物的活性低，其余動力學參數未被確定。

通過克隆表達來源于L. acidophilusNCFM的亞油酸水合酶，Volkov等[50]研究證明亞油酸水合酶是由591個殘基組成的蛋白質，晶體結構如圖4所示。亞油酸水合酶是同型二聚體，每個單體含4個結構域；白色通道和黃色通道分別是底物和FAD結合通道；與其它FAD依賴性酶相比，多了第4個黃色結構域；亞油酸水合酶的第4個域位于C端，由三個螺旋組成，它覆蓋從蛋白質表面通向活性位點的疏水底物通道的入口。在亞油酸存在的情況下，一個原基的第四個域發生構象變化，打開了同型二聚體的另一個原基的底物結合通道的入口。亞油酸分子結合在底物通道的入口，表明底物識別觸發了蓋子域的運動。亞油酸水合酶合成10-HOE及13-HOE原理如圖5所示，通過亞油酸水合酶，可將亞油酸特異性轉化為10-HOE和13-HOE，其中羥基來自于一個水分子[44]。亞油酸水合酶具有底物專一性，且因其種類不同對亞油酸不飽和鍵區域選擇性不同，其晶體結構決定了該水合酶的FAD依賴性。據現有關于亞油酸水合酶動力學研究表明，野生菌中獲得的13-LHT的活性均普遍高于10-LHT，高效10-LHT的篩選仍有較大的空白，有待繼續探索。

圖5 亞油酸水合酶催化合成10-HOE（A）和13-HOE（B）的反應式Fig.5 Synthesis of 10-HOE (A) and 13-HOE (B)by linoleic acid hydratase

2.3 亞油酸水合酶合成HUFA

10-HOE及13-HOE主要通過含有亞油酸水合酶的野生菌轉化亞油酸獲得，但野生菌篩選過程繁瑣，產物復雜，直接使用亞油酸水合酶可高效專一地合成10-HOE及13-HOE，酶法是合成10-HOE及13-HOE的常用方法之一。Oh等[51]克隆了L. acidophilusNBRC 13951中的雙鍵水合酶，這些酶對亞油酸的C-9或C-12雙鍵的水合作用非常專一，因此可以選擇性地從亞油酸中生成10-HOE或13-HOE。Chen等[13]研究L. plantarum、L. reuteri、L. hammesii和L. spicheri中亞油酸水合酶的特性，在Escherichia coli中克隆、表達和純化了10-LHT，建立了10-LHT的酶活測定方法：4.5 mg亞油酸，25 μg純化的10-LHT，在1 mL含50 mmol/L NaCl、2%乙醇和10%甘油的50 mmol/L MES緩沖液（pH=6.1）中，25 ℃轉化3 h。Kim等[15]在E. coli中克隆、表達和純化了10-LHT和13-LHT，研究了兩種酶的底物特異性和反應動力學，系統測定了酶轉化過程中底物和產物濃度的變化，在10-LHT的酶底比是13-LHT的酶底比6倍的條件下，10-HOE、13-HOE的最終摩爾轉化率分別是40%、81%。故目前看來13-LHT的酶轉化效率要高于10-LHT，但酶轉化相關研究報道較少，需要進行更多酶學特性研究和產物合成研究。

2.4 細胞轉化合成

細胞轉化主要是通過含有LHT的野生菌或基因工程菌進行轉化合成。與酶法合成相比，細胞轉化法簡化了酶的提取純化步驟，合成過程較簡便。目前，多組研究發現L. plantarum[13]、L. acidophilus[14]、Nocardia cholesterolicum[52]等野生菌細胞具備合成HUFA的能力。其中以2 g/L亞油酸為底物，pH為6.5，在30 ℃轉化7 d，L. acidophilus13951可合成65%的13-HOE，而Lacticaseibacillus paracaseisubsp.paracaseiJCM 1111對10-HOE的合成轉化率達到91%，是目前野生菌合成10-HOE及13-HOE產量最高的報道[27]。

與野生菌相比，基因工程菌可專一性大量表達目標酶，細胞轉化效率高、產物雜質少，因而基因工程菌細胞轉化是產業化生產10-HOE和13-HOE的有效途徑[13-14]。楊波[53]通過基因工程將L. plantarumZS2058中的10-LHT表達至大腸桿菌中，0.5 mg/mL濕菌體重懸于KPB緩沖液（pH6.0），37 ℃、200 r/min下進行簡單的細胞轉化6 h，重組大腸桿菌在輔酶因子FAD及NADH的催化下反應累積得到產物10-HOE。2015年Park等[14]在大腸桿菌中表達了L. acidophilus中的13-LHT，優化的表達條件為：50 mmol/L檸檬酸/磷酸鹽緩沖液（pH6.0）中，加入0.25%（v/v）Tween 40、25 g/L菌泥和100 g/L亞油酸，40 ℃反應3 h，最終獲得79%的13-HOE合成產率。與13-HOE相比，還未有文獻報道工程菌在高底物濃度條件下高效率合成10-HOE。

3 展望

HUFA具有多種功能特性，特別是10-HOE和13-HOE可作為一類新型天然抗真菌防腐劑應用于食品防腐[30,54-55]。目前關于10-HOE及13-HOE的性質及應用研究剛起步，亞油酸水合酶的底物特性研究不完整，尤其關于10-LHT的高效轉化未有具體報道，HUFA的抗真菌機制尚未深入解釋，10-HOE及13-HOE更多的食用藥用價值有待挖掘。此外，HUFA的酶法合成及細胞轉化合成僅局限于酶學特性研究或實驗室轉化條件優化，轉化效率較低，無法應用于工業生產，后續研究可通過酶和細胞的有效荷載、納米乳液、皮克林乳液等膠體界面化學理論，來定向提高HUFA生物合成體系的轉化效率。