魯西黑頭羊肌肉細胞體外培養及誘導分化研究

劉昭華，王可*，崔緒奎，靳青，朱榮生，王建英，孟憲鋒，張冬梅，譚秀文

（1.山東省農業科學院畜牧獸醫研究所/山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，山東 濟南 250100；

2.山東省鄒城市畜牧業發展中心，山東 鄒城 273500）

我國肉羊存欄量和羊肉產量均居世界首位，是名副其實的養羊大國。但是羊肉生產仍存在兩大問題：一是隨著我國國民經濟和人民生活水平的不斷提高，羊肉需求量日益擴大，羊肉產量很難滿足市場需求；二是我國肉羊飼養水平較低，市場供應的羊肉品質普遍不高，優質高檔肉甚少。眾所周知，肌肉組織的生長發育直接決定產肉量和肉質。因此，對肉羊肌肉生長發育影響因素進行研究，有利于提高肌肉沉積速度和肉質等級，促進我國肉羊產業的發展。

細胞體外培養是研究肌肉生長發育最有利的工具。這是因為與動物體內試驗相比，體外培養的肌肉細胞遺傳背景、培養條件和活性狀態等都一致，所獲得的試驗結果更穩定、組內數據差異較小，更具有說服力和參考價值［1-3］。然而目前關于肉羊肌肉細胞體外培養的研究甚少，其生長規律并不清楚。不同于其他組織來源的體細胞，肌肉細胞只有分化后才能發揮生理功能，但目前關于肉羊肌肉細胞誘導分化的研究僅局限于驗證其是否具有肌源性，而對支撐生理功能的超微結構研究報道較少。因此，本研究建立魯西黑頭羊肌肉細胞體外培養體系，并對其生長規律、誘導分化以及超微結構等進行探討，旨在為肌肉細胞研究提供生長和分化特性等方面的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要試劑 0.25%胰酶、DMEM/F12培養液，購自美國Gibco公司；馬血清（HS）、胎牛血清（FBS）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、三抗混合液（青霉素、鏈霉素和兩性霉素），購自以色列BI公司；生肌決定因子（MyoD1）抗體、成肌調節因子（Myf5）抗體，購自北京Bioss公司；山羊抗兔IgG/FITC抗體，購自美國Jackson ImmunoResearch公司。

1.1.2 主要儀器 CO2細胞培養箱（美國Thermo公司），倒置相差顯微鏡及全自動顯微攝像裝置（日本Nikon公司），Moxi Z微型自動細胞計數儀（美國ORFLO公司），流氏細胞儀（美國BD公司），掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡（日本HITACHI公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 肌肉細胞培養 將剛出生的魯西黑頭羊羔羊從養殖場立即送到無菌室的準備間，窒息處死羔羊后剪開后腿內側皮膚，剪下3～4塊1～2 cm3的肌肉組織，置于裝有PBS液（含2%三抗）的50 mL離心管中并放至超凈工作臺內。用眼科鑷子將肌肉組織放在無菌塑料平皿上，PBS液（含2%三抗）清洗3～5次，將外圍組織去除，剩余組織繼續用PBS液清洗2～3遍后放在干燥的平皿上，剪碎約至1 mm3大小，加入0.25%胰酶（含0.05%EDTA）放置4℃冰箱過夜。第2 d放置37℃培養箱內消化1 h，加入含10%FBS的DMEM/F12培養液終止消化，用移液器輕輕吹打至組織塊基本消失，先過400目細胞篩，收集濾液再過200目細胞篩，之后收集濾液300×g離心5 min，收集細胞沉淀后再用細胞培養液離心洗滌1次，加入細胞培養液（DMEM/F12+10%FBS+1%三抗）重懸接種到培養瓶內，于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱內培養。

1.2.2 肌源性鑒定 待細胞貼壁至80%～90%時棄掉培養液，加入0.25%胰酶（含0.05%EDTA），置于37℃培養箱消化處理3～5 min，待細胞徹底消化下來后加入培養液中和，300×g、5 min離心收集細胞，加入固定液室溫處理30 min，離心后棄上清液。加入含0.1%Trinton X-100的PBS液處理10 min，離心棄上清液，加入含3%BSA的PBS液處理2 h，之后加入一抗（MyoD1或Myf5）或對照IgG，4℃孵育過夜。離心去除一抗，加入FITC連接的山羊抗兔IgG二抗，室溫避光孵育1 h。離心去上清液，將細胞重懸于200μL PBS液中，利用流式細胞儀進行MyoD1或Myf5表達檢測。

1.2.3 生長曲線繪制 將細胞按1×104個/mL接種到6孔培養板中，接種當日記為0 d，接種第2日記為1 d。每天盲選1個培養板，棄掉培養液，每孔加入1 mL 0.25%胰酶（含0.05%EDTA），放置于37℃培養箱消化處理3～5 min，待細胞徹底消化下來后加入2 mL培養液中和，用移液器充分混勻后吸取75μL，加入到芯片進液口處，Moxi Z微型自動細胞計數儀立即讀數。剩余未處理的細胞隔天換液，直到試驗結束。

1.2.4 成肌誘導 將細胞按1×104個/mL接種到T25培養瓶中，待細胞貼滿培養瓶底壁時棄掉培養液，加入5 mL成肌誘導培養液（DMEM/F12+2%HS+1%三抗），放置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱內培養，隔天換液。

1.2.5 樣品處理及電鏡觀察 將細胞按1×104個/mL接種到T75培養瓶中，待細胞貼壁90%～100%時，用塑料細胞刮將細胞輕輕刮下來，300×g、5 min離心收集細胞，加入電鏡固定液放置4℃冰箱保存。誘導分化肌肉細胞樣品的制備按成肌誘導處理，待形成肌管時收集細胞、固定保存。

透射電鏡樣品處理主要包括：（1）瓊脂預包埋：將固定處理的細胞離心，棄上清加入PBS，混勻漂洗3 min后再離心，重復洗滌3次。提前加熱溶解制備1%瓊脂糖溶液，稍冷卻后加入1.5 mL離心管內，在瓊脂糖凝固之前將沉淀用鑷子挑起懸浮包裹于瓊脂糖內。（2）后固定：PBS配制的1%鋨酸避光室溫固定2 h，PBS漂洗3次，每次15 min。（3）室溫脫水：樣品依次入30%、50%、70%、80%、95%、100%、100%酒精上行脫水，每次20 min，100%丙酮兩次，每次15 min。（4）滲透包埋：丙酮∶812包埋劑=1∶1于37℃處理2～4 h，丙酮∶812包埋劑=1∶2于37℃滲透過夜，純812包埋劑于37℃處理5～8 h。將純812包埋劑倒入包埋板，將樣品插入包埋板后37℃烤箱過夜。（5）聚合：包埋板放于60℃烤箱聚合48 h，取出樹脂塊備用。（6）超薄切片：樹脂塊于超薄切片機60～80 nm超薄切片，150目方華膜銅網撈片。（7）染色：銅網于2%醋酸鈾飽和酒精溶液避光染色8 min；70%酒精清洗3次；超純水清洗3次；2.6%枸櫞酸鉛溶液避二氧化碳染色8 min；超純水清洗3次，濾紙稍吸干。銅網切片放入銅網盒內室溫干燥過夜。（8）透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

掃描電鏡樣品處理主要包括：（1）后固定：固定好的樣品經PBS漂洗3次，每次15 min。PBS配制1%鋨酸室溫避光固定1～2 h。PBS漂洗3次，每次15 min。（2）脫水：樣品依次入30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%、100%酒精各15 min，乙酸異戊酯15 min。（3）干燥：將樣品放入臨界點干燥儀內進行干燥。（4）樣品導電處理：將樣品緊貼于導電碳膜雙面膠上放入離子濺射儀樣品臺上進行噴金30 s左右。（5）掃描電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

1.3 數據分析

采用SPSS 19.0統計軟件進行分析，數據以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 肌肉細胞生長情況

肌肉細胞接種培養后，經過短暫的懸浮狀態然后貼壁擴增，其形態隨著培養時間的延長而發生改變（圖1）。第1 d（接種當日記為0 d），細胞散在貼壁生長，呈不規則多角形；隨著細胞不斷分裂擴增，生長空間逐漸減少，第3 d細胞呈長條形；第6 d開始零星出現分化的肌管，隨培養時間的延長，肌管越來越多；直到20 d左右，肌肉細胞全部分化為肌管；之后肌管開始聚集、隆起，最后形成團狀類似肉糜的顆粒。

圖1 不同培養天數肌肉細胞生長形態（100×）

肌肉細胞在最初的1～2 d內處于緩慢生長的潛伏期；從第3 d開始直到第6 d，細胞進入快速生長的指數增長期；從第7 d開始直到第20 d左右，細胞生長達到飽和密度進入平臺期；從第21 d開始，細胞數量逐漸降低，進入衰退期（圖2）。

圖2 肌肉細胞生長曲線

2.2 肌源性鑒定

利用流式細胞儀檢測肌肉細胞表達MyoD1和Myf5陽性率，結果（圖3）發現，MyoD1和Myf5表達陽性率均在95%以上，說明培養的肌肉細胞純度較高。

圖3 肌肉細胞MyoD1和Myf5陽性率

2.3 誘導分化

細胞接種培養后，于第3 d完全貼滿培養瓶底壁，這時更換誘導分化液或正常換液（即為分化處理的第1 d），結果（表1、圖4）發現，正常換液組出現肌管時間為分化處理的第4 d，肌管聚集時間為第19 d；誘導分化組出現肌管時間為分化處理的第2 d，肌管聚集時間為第5 d。說明自然狀態下肌肉細胞也能分化成肌管，但分化進程較誘導分化慢。

表1 肌肉細胞在自然或誘導下的分化進程 （d）

圖4 肌肉細胞在自然或誘導下的分化形態（100×）

2.4 超微結構

肌肉細胞經誘導分化后，其超微結構如圖5、圖6所示。細胞呈扁平、不規則長條形，簇擁疊壓在一起；細胞表面伸出絲足，質膜分布有很多空隙孔。線粒體十分豐富，為橢圓形，內嵴發達、致密；核膜完整，核內有電子致密的核仁；核膜外側有數量較多的糙面內質網，表面核糖體清晰可見；脂滴的電子密度均勻，大量糖原散在細胞質中；肌原纖維束致密、排列規則；細胞間緊密連接明顯。

圖5 肌肉細胞膜表面超微結構

3 討論與結論

魯西黑頭羊是山東省農業科學院培育的綿羊新品種，因其具有早熟、多胎、生長發育快、肉質好等優良特性，目前已成為山東省肉羊養殖的主推品種，也被新疆、黑龍江、青海、內蒙古、河南等省（區）引種推廣，取得了良好的經濟效益。為了更好地研究和利用魯西黑頭羊優良的肉質特性，本研究構建科學、高效的魯西黑頭羊肌肉細胞培養體系，為后續進行肉質和生長速度研究提供有利工具。

目前肌肉細胞培養主要采取兩種方法，即組織塊培養法［4］和酶消化法［5］。組織塊培養法直接在培養瓶/培養皿內接種剪碎的肌肉組織小塊，10～15 d后細胞從組織塊周圍游離生長出來，細胞密度不均勻，生長狀態不一致；酶消化法將剪碎的肌肉組織小塊進一步加入蛋白酶消化處理成單個游離的細胞，加入培養液后培養，第2 d有細胞散在貼壁生長，細胞分布均勻，生長狀態一致。因此，本研究利用0.25%胰酶（含0.05%EDTA）消化處理肌肉組織，放置4℃冰箱過夜；為獲得更好的消化效果，第2 d于37℃繼續消化1 h，這樣既讓胰酶充分浸入組織，又不會造成消化過度，提高細胞活性，利于貼壁生長。

生長曲線是反映細胞增殖速度的重要指標，包括潛伏期、指數增長期、平臺期和衰退期四個階段。細胞接種后經過短暫的懸浮狀態，然后貼壁生長，不斷擴增。在培養的最初幾天，肌肉細胞增殖速度相對較慢，處于潛伏期。潛伏期時間長短不定，1.5 d［6］、3 d［7］都有報道，本研究中潛伏期為2 d，這可能與接種的密度、提供的營養物質、培養環境不同有關。之后細胞進入指數增殖期，這一時期細胞分裂速度最快，大量擴增并擠壓生長空間，細胞由最初的不規則多角形變為長條形。指數增殖期維持4 d左右，與Wu等［7］報道的基本一致。由于細胞存在生長接觸抑制，在生長空間消耗殆盡的情況下，細胞不再增殖，這時處于平臺期。本研究中肌肉細胞平臺期持續13 d左右，與其他組織來源的細胞相比［8-10］，處于平臺期的時間較長。這可能因為這一時期肌肉細胞雖然不再增殖，但在營養物質充足的情況下，細胞開始分化，與出現肌管的時間點一致。

體外培養的肌肉細胞在分化階段發揮其生理功能。細胞出現接觸抑制后不再增殖，但在營養物質充足的情況下能自發分化成肌管，但分化速度較慢。采用含有特定物質的培養液對肌肉細胞進行誘導分化能夠提高分化速度和效率。已有報道表明，不同物種的肌肉細胞進行成肌誘導采用在培養液中添加2%馬血清［11，12］，也有報道采用10%馬血清［13］。本研究采用在DMEM/F12培養液中添加2%馬血清進行成肌誘導，取得了很好的分化效果。但試驗中發現必須在肌肉細胞出現接觸抑制后進行誘導分化，如果提前換入誘導分化液，2%馬血清不能滿足細胞繼續增殖的營養需要，就不會出現生長接觸抑制，也就不能進行分化，這一結果與Wu等［7］的結果不一致。

超微結構是細胞發揮生理功能的物質基礎。本研究利用掃描電鏡觀察到分化的肌肉細胞呈長條形，簇擁擠壓在一起，與光鏡觀察到的結果一致。肌肉細胞在增殖階段由于存在生長接觸抑制，所以細胞都是單層擴增直至貼滿；誘導分化后則突破這一限制，細胞聚集、隆起，最后形成團狀結構，這與小鼠肌肉細胞［13］、牛肌肉細胞［14］誘導分化結果一致。肌肉細胞由于自身的運動屬性，肌原纖維非常發達。本研究發現，大量肌原纖維成束存在，有的存在于質膜附近，有的在胞漿里面。胞漿內含有大量的糖原和脂肪滴，線粒體十分豐富，內嵴致密、發達，可為肌肉細胞活動提供能量。糙面內質網發達，表面核糖體清晰可見，可進行合成蛋白的轉運。這些細胞器正常、有序的運行，能夠為肌肉細胞生長和發揮功能提供有利保障。

本研究利用酶消化法成功構建魯西黑頭羊肌肉細胞培養體系，首次報道肌肉細胞不同于其他組織來源細胞的生長規律，以及誘導分化后符合自身運動屬性特征的超微結構。