豬丹毒桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)研究

張瑞華，任丹寧，高善頌，竇心怡，張丹萍，李煥發(fā)，韓先杰

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266109）

豬丹毒病（swine erysipelas）主要有急性、亞急性和慢性三種病型［1］。該病主要靠接觸傳播，豬最為易感，各日齡的豬均可感染，多數(shù)發(fā)生于架子豬。天氣突變情況易導(dǎo)致動物發(fā)病；也可因豬場飼養(yǎng)環(huán)境較差，動物的抵抗力下降而發(fā)病。多數(shù)發(fā)生在悶熱的夏季，其他季節(jié)也有發(fā)生［2］。

豬丹毒桿菌菌體細(xì)長，大多數(shù)呈直或稍彎曲狀。該菌血清型復(fù)雜，目前有26種血清型，對養(yǎng)豬業(yè)危害較大的血清型有1a、1b、2a、2b等。1a亞型多從急性病例中分離到，2型多從亞急性或慢性病豬中分離到［3，4］。

豬丹毒桿菌的毒力因子主要為神經(jīng)氨酸酶，目前尚未發(fā)現(xiàn)有外毒素的產(chǎn)生。在神經(jīng)氨酸酶的作用下，宿主組織黏蛋白、血纖維蛋白原等被除去，因此黏蛋白對機(jī)體的保護(hù)作用大大減弱［5］。急性型血液中存在大量神經(jīng)氨酸酶，引起全身各處毛細(xì)血管通透性增高或產(chǎn)生血栓，從而表現(xiàn)出敗血癥相應(yīng)癥狀。急性敗血型在養(yǎng)殖過程中比較多見，一般病豬會在較短時間內(nèi)死亡，大多高熱稽留、結(jié)膜充血、糞便干燥，部分病豬以皮膚發(fā)紅為主要癥狀［6，7］。在亞急性病例中，神經(jīng)氨酸酶僅作用于存在于皮膚局部的微血管和淋巴間隙，從而在患病動物皮膚上出現(xiàn)類似“打火印”樣的疹塊。在慢性病例中，細(xì)菌會長時間停留在動物體內(nèi)，特別是心內(nèi)膜、關(guān)節(jié)內(nèi)以及皮膚，從而引起動物的關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎以及皮膚壞死［8，9］。

2018年12月，即墨某豬場發(fā)病豬突然發(fā)病死亡，在其腹下及股內(nèi)側(cè)皮膚有大小不一的紅斑。剖檢發(fā)現(xiàn)其腎臟腫大、呈暗紅色，脾臟腫大，全身淋巴結(jié)腫脹充血。為確定病因，本研究對該病死豬進(jìn)行病原菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)，以期為豬丹毒病的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源

病死仔豬（40 kg左右），即墨某豬場提供。

1.2 主要試劑

革蘭氏染液試劑盒、Mueller-Hinton瓊脂、綿羊血培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂、細(xì)菌微量生化鑒定管，均購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；PCR反應(yīng)試劑等，購自青島紫恩生物科技有限公司；藥敏試紙，購自青島科盛源科技發(fā)展有限公司；20～24 g健康昆明系小白鼠，購自青島大任富城畜牧有限公司。

1.3 細(xì)菌的分離培養(yǎng)及純化

采集病死豬的脾臟和肺臟等組織，放在干凈托盤里并移至超凈工作臺中，使用接種環(huán)無菌蘸取少量組織后，在綿羊血培養(yǎng)基上三區(qū)劃線，37℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48 h后查看其生長情況。挑取單個優(yōu)勢菌落接種到血平板進(jìn)行純培養(yǎng)，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48 h。用接種環(huán)挑取單菌落至載玻片進(jìn)行革蘭氏染色，觀察細(xì)菌形態(tài)。從純培養(yǎng)的血平板上挑取單個菌落至腦心浸液肉湯中，置于37℃振蕩培養(yǎng)箱中增殖培養(yǎng)24～48 h。

1.4 GroEl基因鑒定

用水煮法提取分離菌DNA，并置于冰箱中冷凍保存?zhèn)溆谩ａ槍ωi丹毒桿菌GroEl基因設(shè)計一對特異性引物（表1），進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系（25μL）：上游引物（F）1.0μL，下游引物（R）1.0μL，2×Master Mix 12.5μL，DNA模板1.5μL，滅菌去離子水9.0μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，50℃退火15 s，72℃延伸35 s，共32個循環(huán)；72℃終延伸5 min，10℃結(jié)束反應(yīng)并保存。

表1 擴(kuò)增豬丹毒桿菌GroEl基因的引物序列

吸取5μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳（115 V，25 min），并將擴(kuò)增產(chǎn)物交由青島派森諾基因生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，利用NCBI的BLAST工具對分離菌的GroEl基因序列進(jìn)行同源性比對。

1.5 生化鑒定

將菌液離心后使用生理鹽水洗滌兩次，接種于生化鑒定管，具體參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》［10］和中華人民共和國豬丹毒行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NYT 566—2002［11］進(jìn)行，培養(yǎng)結(jié)束后按照說明進(jìn)行結(jié)果判定。

1.6 動物試驗(yàn)

將分離純化的豬丹毒桿菌接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)18～24 h，并計算活菌數(shù)。采用改良寇氏法對分離菌進(jìn)行LD50的測定，設(shè)置濃度為104、105、106cfu/mL攻毒組，每組隨機(jī)選取8只健康小白鼠。每個攻毒組腹腔注射不同濃度的菌液0.3 mL。連續(xù)3 d觀察死亡情況，計算LD50值。小鼠死亡后，解剖小鼠并觀察其內(nèi)臟病理變化，分離細(xì)菌對其進(jìn)行鑒定。

1.7 藥物敏感性試驗(yàn)

使用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法（Kirby-Bauer）對分離到的菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)［12］和青島科盛源科技發(fā)展有限公司提供的紙片法藥敏試驗(yàn)指導(dǎo)判定該菌對各種藥物的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌形態(tài)和培養(yǎng)特性

分離菌經(jīng)37℃培養(yǎng)24 h，在綿羊血培養(yǎng)基上生長良好，表現(xiàn)為菌落細(xì)小，似針尖；培養(yǎng)48 h后菌落呈灰白色，邊緣整齊、光滑、濕潤，有α溶血現(xiàn)象（圖1、圖2）。細(xì)菌經(jīng)革蘭氏染色后，鏡檢顯示為革蘭氏陽性、細(xì)長桿菌（圖3）。

圖1 綿羊血培養(yǎng)基上分離菌的菌落形態(tài)

圖2 分離菌的溶血現(xiàn)象

圖3 顯微鏡下細(xì)菌形態(tài)（1 000×）

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

生化鑒定結(jié)果顯示該株細(xì)菌能發(fā)酵葡萄糖、果糖、乳糖，不能發(fā)酵甘露醇、菊糖、山梨醇、棉籽糖、水楊酸、蕈糖、海藻糖等（表2）。根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》［10］，符合豬丹毒桿菌的生化鑒定特佂。

表2 生化試驗(yàn)結(jié)果

2.3 分子鑒定

電泳結(jié)果顯示，出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的目的條帶，約377 bp（圖4）。利用NCBI的BLAST工具將分離菌GroEL基因序列與數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行同源性比對，結(jié)果顯示該菌與豬丹毒桿菌序列同源性為99%；GroEl基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，分離株與Erysipelothrix rhusiopathiaeSY1027和Erysipelothrix rhusiopathiaestr.Fujisawa在同一分支，親緣關(guān)系較近（圖5）。結(jié)合菌落形態(tài)和生化試驗(yàn)結(jié)果，可以確定分離菌株為豬丹毒桿菌。

圖4 PCR擴(kuò)增GroEl基因結(jié)果

圖5 GroEl基因進(jìn)化樹分析

2.4 動物試驗(yàn)結(jié)果

攻毒后小鼠先后出現(xiàn)精神不振、食欲不佳、不愿活動、被毛蓬亂、身體蜷縮、喜閉眼等表現(xiàn)；3 d后全部死亡。表明該菌對小鼠有較強(qiáng)的致病力。經(jīng)計算得到分離株的LD50為1.6×105cfu/mL。對死亡小鼠進(jìn)行解剖，發(fā)現(xiàn)其肝臟、脾臟等多處內(nèi)臟腫脹充血。在死亡小鼠腹腔內(nèi)用接種環(huán)取菌，在血平板上劃線，37℃恒溫箱培養(yǎng)24～48 h，細(xì)菌生長情況和感染菌株形態(tài)一致（圖6），革蘭氏染色可見短桿狀陽性菌（圖7）。取該菌提取DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增后電泳，可觀察到大小377 bp左右的目的條帶。由此可以判斷小鼠感染的菌為分離到的豬丹毒桿菌。

圖6 小鼠腹腔分離菌培養(yǎng)生長情況

圖7 小鼠腹腔分離菌革蘭氏染色結(jié)果（1 000×）

2.5 藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株對恩諾沙星、頭孢克肟、氟苯尼考、氨芐西林、卡那霉素、慶大霉素、阿莫西林敏感，對青霉素和鏈霉素中度敏感，對林可霉素耐藥（表3）。根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，選取恩諾沙星、阿莫西林等進(jìn)行治療，效果良好。

表3 分離菌藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

豬紅斑丹毒絲菌最早于1882年分離得到［13］，在世界范圍內(nèi)廣泛分布，給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失［14］。近年來，由于養(yǎng)豬場抗生素的廣泛使用和飼養(yǎng)環(huán)境的改善，豬丹毒病已很少出現(xiàn)。許多規(guī)模化養(yǎng)豬場已經(jīng)不再接種豬丹毒疫苗，但在我國江西、浙江、湖南、福建等地還有豬丹毒病例的報道［15，16］。

本次實(shí)驗(yàn)室所接到的病例為急性敗血型，急性病例病程發(fā)展較快，死亡率高，而且多數(shù)預(yù)后不良；在臨床上，豬藍(lán)耳病、急性敗血性豬鏈球菌病以及急性敗血性豬傳染性胸膜肺炎等疾病的臨床表現(xiàn)和病理變化與本病有相似之處。因此在疾病發(fā)生時，應(yīng)盡快將病料低溫送至檢測單位，經(jīng)過一系列檢查，確診后對癥下藥，并對豬場其他健康豬群進(jìn)行提早預(yù)防，以減少經(jīng)濟(jì)損失。

本試驗(yàn)從病死仔豬脾臟、肺臟中分離到1株細(xì)菌，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢、形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗(yàn)和PCR擴(kuò)增鑒定為豬丹毒桿菌。小鼠攻毒試驗(yàn)表明該菌有較強(qiáng)致病性，藥敏試驗(yàn)證明該分離菌對恩諾沙星、阿莫西林等敏感且治療效果良好。