梨樹專用肥對翠冠梨樹體營養水平及土壤微生物群落的影響

施春暉，王曉慶，張靜增，李英麗，金風雷，張玉星，駱 軍

(1.上海市農業科學院 林果果樹研究所，上海 201403；2.上海市設施園藝重點實驗室，上海 201403；3.河北農業大學 園藝學院，河北 保定 071001；4.上海松江區梨樹研究所，上海 201699)

中國是砂梨(PyruspyrifoliaNakai.)的起源中心，同時也是世界上砂梨資源最豐富的國家，近10年來，早熟砂梨在長江流域及長江以南地區快速發展。砂梨樹體營養狀況是決定果實優質、豐產的關鍵。

在傳統砂梨生產中，種植者往往重視樹體管理多于土壤管理，缺乏精準施肥的管理意識。事實上，根據具體樹體的營養診斷結果制定科學合理的施肥方法才是有效改善樹體營養狀況的最佳途徑[1]。20世紀70年代果實營養診斷的研究與應用起步，隨著營養學科的不斷發展，學者們提出了綜合診斷法(Diagnosis and Recommendation Integrated System，DRIS)[2]，我國開展關于樹體營養診斷的研究雖然起步較晚但發展迅猛，目前已建立了柑橘[3]、梨[4]、蘋果[5]、芒果[6]等果樹樹種營養診斷標準，并在此基礎上進一步對需肥次序做出診斷。王國英等[4]建立了黃冠梨營養診斷施肥標準，并提出了有針對性的優質配方肥。侯岑[7]建立了適于江蘇、浙江、湖北、四川和福建這5省的翠冠梨葉片礦質營養診斷標準值。

目前，翠冠梨按需科學施配方肥方面的研究較少，未能充分發揮土壤營養水平對果實產量及品質的提升，也鮮見配方肥對土壤微生物環境研究的相關報道。本文以翠冠為研究對象，通過在果實發育期施用梨有機無機專用平衡肥，以常規施化肥為對照處理，研究了施肥對翠冠梨樹產量及品質、土壤及梨葉片中營養水平、土壤微生物環境的影響，以期達到進一步按樹體需求優化專用肥配方的目的，從根本上改變現階段落后的施肥現狀，為提高早熟砂梨果實品質、獲得良好經濟效益提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點

施肥試驗于2018～2020年在上海市崇明區廟鎮鴿龍村進行，位于東經121°39′、北緯31°62′。崇明區屬亞熱帶季風氣候，年平均氣溫16.5 ℃，年平均降雨量1128.9 mm。果園排水通暢，土壤類型為砂質壤土，肥力中等。該地區是上海市梨產業發展的優勢產區。

1.2 試驗材料及設計

選園內樹齡為12 a的盛果期翠冠品種為研究對象，樹形為三主枝開心形，株行距 2.5 m×3.5 m；2018～2020年選擇樹體管理較為一致的樹，每年采收前4周進行施肥處理，以單株為試驗小區進行取樣。選用由河北農業大學研制的梨有機無機專用平衡肥(Special balanced fertilizer， SBF)，在采收前4周按每50 kg果施入3 kg肥的量采用溝施方式一次性施入；對照施用常規復合肥(化肥)(Chemical fertilizer，CF)，生長季坐果后應施膨果肥，每株施三元復合肥(N-P2O5-K2O)0.5 kg；果實膨大期每株用高鉀硫基復合肥(N-P2O5-K2O比例為14∶14 ∶30的水溶肥)0.1 kg 沖施。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的采集與處理 連續兩年，每年6月底采集葉片，7月底到8月初采集果實測定品質及產量；春季前采集土樣分析土樣營養水平及微生物環境。葉片采集及處理參考王國英等[4]的方法。

土樣采集及處理：于10月底采土。采取五點交叉取樣法，于樹冠垂直投影處，用土鉆分別取0～20 cm和20～40 cm土層的土，每個樣由同一土層的5個點組成，混合后用四分法留樣2 kg左右。將其中50 g土放入50 mL離心管中，將離心管立即放入裝有干冰的泡沫箱中保存，帶回實驗室放入-80 ℃冰箱保存，用于土壤微生物測序分析。每個樣設8個重復。剩下的土壤放在掛有樣品標簽的塑料袋中，帶回實驗室攤開晾干，用榔頭砸碎后過0.25 mm孔徑的篩，保存于信封中，待測土壤pH值、EC值以及土壤大量、中量及微量元素。

果實取樣及處理：在翠冠梨采收期，以單株為單位統計全樹的結果量，統計單株產量，每個處理5個重復。單果重用電子天平稱量，果實可溶性固形物用手持儀(ATAGO Master-20a，日本)測定。

1.3.2 樣品測定 葉片元素測定參考王國英等[4]的方法。

土壤營養成分的測定參照王曉慶等[8]關于土壤pH值、電導率(EC)以及土壤中元素測定方法，其中土壤pH值、電導率(EC)分別利用電極法和電位法，有機質含量利用重鉻酸鉀容量法測定，堿解氮采用堿解-擴散吸收法測定，有效磷含量采用碳酸氫鈉提取-鉬銻抗比色法測定，速效鉀含量利用乙酸銨提取-火焰光度法測定。

土壤微生物環境檢測利用16S rDNA 測序，具體采用Nossa等的方法[9]。采用 DNA 抽提試劑盒對土壤樣本的基因組 DNA 進行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA 的純度和濃度。以稀釋后的基因組 DNA 為模板，根據16S V3～V4 區域，使用帶 barcode 的特異引物343F(5’- TACGGRAGGCAGCAG -3’)和798R(5’- AGGGTATCTAATCCT-3’)，利用Takara Ex Taq高保真酶進行PCR。PCR產物使用電泳檢測，檢測后使用磁珠純化，純化后作為二輪PCR模板，并進行二輪PCR擴增，并再次使用電泳檢測，檢測后使用磁珠純化，純化后對PCR產物進行Qubit定量。根據PCR產物濃度進行等量混樣，并上機測序(Agilent 2100 Bioanalyzer, USA)。下機后獲得原始數據為FASTQ格式。使用Trimmomatic軟件[10]對原始雙端序列進行去雜。同時，利用UCHIME檢測并去除序列中的嵌合體序列[11]。對測序數據進行預處理，生成優質序列之后，采用Vsearch軟件[12]，根據序列的相似性，將序列歸為多個OTU。序列相似度大于或等于97%被歸為一個OTU單元。使用QIIME軟件包[13]挑選出各個OTU的代表序列，并將所有代表序列與數據庫進行比對注釋。16S使用Greengenes或者Silva(version123)數據庫比對，18S使用Silva(version123)數據庫比對，物種比對注釋使用RDP classifier軟件[14]，保留置信區間大于0.7的注釋結果。ITS使用Unite數據庫比對。物種比對注釋使用blast軟件[15]。

1.4 數據處理

試驗結果的數據表示為平均值±標準差(SD)。數據處理采用 Excel 2010 軟件，顯著性分析采用 SPSS 17．0 數據處理系統。

2 結果與分析

2.1 梨專用肥對果實品質及產量的影響

對經過3年SBF處理和對照CF處理的翠冠梨的果實產量及品質進行比較，由表1可知，SBF處理和CF處理在前兩年對果實單果重的影響不顯著，第3年SBF處理后果實單果重較CF處理顯著提高了7.9%，平均單果重達402.65 g。雖然兩種肥料處理對單株結果量的影響不顯著，但由于SBF處理顯著增加了單果重，使得SBF處理的產量達4811.14 kg/667 m2，與CF處理比較提高了23.45%，差異達極顯著水平。在品質方面，與對照CF處理相比，SBF處理后的第一年即2018年果實的可溶性固形物含量便有極顯著的提高，提高了0.97個百分點，平均可溶性固形物含量為12.12%；第2年和第3年SBF處理相比于CF處理，平均可溶性固形物含量分別提高了0.80和0.29個百分點，差異均達顯著水平。

2.2 梨專用肥對樹體營養水平的影響

2020年對持續3年進行SBF和CF肥料試驗處理的梨樹葉片進行營養元素的測定及分析， 6月底氮元素含量變化較為平穩，是測定氮元素含量的適宜采樣時期，采集新梢中段成熟功能葉片，經測定后結果見表2。處理間梨葉片中常量元素N、K、Ca元素的含量存在顯著差異，其中SBF處理葉片中的N元素含量顯著高于CF處理的；SBF處理后葉片中的K元素含量比CF處理顯著下降了0.04個百分點。處理間梨葉片中微量元素Zn、Fe、Mn、B的含量存在顯著差異，其中SBF處理中Mn和Fe元素含量分別極顯著、顯著高于CF處理的，分別增加了38.91%和8.19%，而B元素則在CF處理的葉片中含量較高。

表2 不同肥料對梨葉片營養元素含量的影響

2.3 梨專用肥對梨園土壤理化性質及土壤養分的影響

通過對兩種施肥處理的土壤營養水平進行測定，結果(圖1)表明，處理間0～20 cm土壤pH值存在顯著差異，SBF處理后的土壤pH值為7.10，CF處理后的土壤pH值為7.42；在20～40 cm土層中SBF處理的土壤pH值也低于CF處理的，但差異不顯著。土壤中性略微偏堿，略高于南方梨pH適宜值5.8～7.0[17]。土壤有機質含量被視為最重要土壤肥力指標。0～20 cm土層的土壤有機質含量經SBF處理后較對照CF顯著提高，達3.05%，較CF土壤有機質含量高8.54%。土壤水解性氮或稱堿解氮(有效氮)能反映土壤近期內氮素供應情況，包括無機態氮(銨態氮、硝態氮)及易水解的有機態氮(氨基酸、酰銨和易水解蛋白質)。在0～20 cm土層中，經SBF處理的有效氮含量顯著低于CF處理的，達11.17%； 在20～40 cm土層中，經SBF處理的有效氮含量比CF處理顯著降低28.57%。而20～40 cm土層中經SBF處理的土壤有效磷含量較對照CF處理增高了21.26%。速效鉀含量的差異主要存在于20～40 cm的土層中，其中CF的速效鉀含量是SBF處理的2.39倍。

圖1 不同肥料對梨園土壤營養水平的影響

2.4 梨專用肥對梨園土壤微生物菌群的影響

2.4.1 梨專用肥處理土壤細菌屬水平主要物種豐度及多樣性指數 通過16S rDNA基因高通量測序分析結果(圖2)表明，兩個施肥處理后土壤樣品的稀釋曲線逐漸趨于平緩，表明取樣合理，測序片段讀取基本飽和，并且兩個處理的取樣，具有很強的代表性。由表3可知，兩個施肥處理的土壤微生物多樣性指數存在顯著性差異，SBF和CF處理的土壤微生物平均OTU分別為4123和3897，兩者差異顯著。SBF處理的Chao1、ACE參數顯著高于CF，表明SBF處理土壤的微生物群落多樣性增加。

表3 不同肥料處理的土壤微生物多樣性指數

2.4.2 梨專用肥處理對土壤微生物多樣性的影響 根據土壤處理樣本SBF和CF微生物群落主要物種注釋及豐度數據分析，微生物群落在門水平上豐度最高的4個門分別為變形細菌(57.64%)、芽孢桿菌(8.73%)、放線菌(8.16%)、酸菌(7.74%)。選取豐度排名前30位的屬進行比較(圖3)，在屬水平上(相對豐度大于1%)，兩個肥料處理后的土壤優勢菌以 MND1慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、羅河桿菌屬(Rhodanobacter)、擬桿菌屬(Bacteroides)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)為主。SBF處理與CF處理相比，擬桿菌屬(Bacteroides)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、馬杜拉放線菌屬 (Actinomadura)、竹桿菌屬(Chujaibacter)相對豐度較高，而硝化螺菌(Nitrospira)在CF處理的土壤中相對豐度較高(圖3)。土壤中Gaiella菌的相對豐度與土壤有機質、有效氮、有效磷、速效鉀含量呈顯著負相關，與電導率EC值成反比；纖維弧菌屬(Cellvibrio)的相對豐度與土壤有機質、有效氮、有效磷、速效鉀含量呈顯著正相關。

圖2 不同肥料處理下對土壤樣品的16S rRNA稀釋曲線

A：MND1羅丹桿菌擬桿菌；B：羅河桿菌Rhodanobacter；C：硝化螺菌Nitrospira；D：竹桿菌Chujaibacter；E：擬桿菌屬Bacteroides；F：海洋粘細菌Haliangium；G：馬杜拉放線菌 Actinomadura；H：雙歧桿菌Bifidobacterium；I：mle1-7；J：Subgroup_10；K：鞘氨醇單胞菌Sphingomonas；L：黃類固醇桿菌 Steroidobacter；M：運動東菌Dongia；N：芽孢桿菌 Gemmatimonas；O：黃桿菌Flavobacterium；P：瘤胃球菌Ruminococcus_2；Q：活潑瘤胃球菌[Ruminococcus] _gnavus_group；L：JdFR-76；S：大腸埃希氏菌 Escherichia-Shigella；T：黃色單胞菌 Luteimonas；U：IS-44；V：放線菌Gaiella；W： Chryseolinea；X：Pseudolabrys；Y：不粘柄菌 Pseudolabrys；Z： 嚴格梭菌 Clostridium_sensu_stricto_1；A1： 生絲微 Hyphomicrobium；B1：分枝桿菌 Mycobacterium；C1：酸桿菌 Acidibacter；D1：地桿菌 Geobacter。

3 討論

梨樹屬于多年生木本植物，生長周期長，通過營養診斷技術發現，在各生長周期梨樹各部位中的礦質營養表現出不同的需肥特點，花后到果實成熟生殖生長階段對元素的需求量增加，種植者需要根據需肥規律通過追肥為根系輸送礦質營養。長期不同的施肥措施會影響土壤養分水平和土壤微生物群落的多樣性[19]。果樹專用肥既具備了無機肥的快速高效性，也具備了有機肥的長效性，能有效提高果實的產量及品質。河北農大根據梨樹、蘋果樹的需肥特點、梨優質豐產葉片營養標準值以及果園營養水平研制了富含梨樹必需營養元素及腐殖質的平衡專用肥，并且在黃冠上施用專用肥后土壤有機質含量比傳統施入化肥有顯著的提高[1，4]。張超等[19]研究發現蘋果專用肥顯著提高了土壤有機質的含量以及微生物群落功能的多樣性。在本研究中，梨專用平衡肥的施用對梨園土壤有機質、土壤有效養分及土壤微生物菌群均有不同程度的提高，與上述的研究結果一致。SBF處理和CF處理后在0～20 cm土層有效氮和速效鉀含量差異不顯著，但其含量在20～40 cm土層化肥CF處理的顯著高于SBF處理的，究其原因可能是化肥短期提高土壤有效養分含量的能力要強于有機肥，以有機肥為主的專用肥雖然肥效較為緩慢，但可有效降低土壤酸堿度，抑制土壤鹽堿化，同時有效提高土壤有機質含量，平均有機質含量達3.05%。黃春輝[20-21]等研究表明土壤有機質含量和可溶性固形物含量之間呈正相關的關系，有機質為土壤提供植物所需的單糖類、氨基酸和維生素等小分子有機物，可有效提升果實的風味，是保證果樹基礎產量及品質的關鍵。

目前，福建、江蘇、浙江制定了高產翠冠梨葉片營養診斷標準值[7, 22]，而上海地區還未見翠冠梨葉片營養診斷標準值的報道。本研究發現葉片中氮含量略低于浙江、江蘇兩地的，但經過施用有機無機專用肥后葉片中的氮含量為2.21%，與常規施化肥的相比有顯著的升高，并且與土壤中的氮含量無顯著相關性，該結果與王曉慶等[9]在同一地區測定的翠冠梨葉片氮含量值相近，并且上海不同地區葉片氮含量值差異明顯，推測這可能與上海地區土壤類型差異相關。SBF處理后的葉片中常量元素Ca、Mg和微量元素Zn、Fe、Mn的含量均比常規化肥CF處理的高，除Fe元素含量偏低以外，其他元素含量均符合高產園翠冠葉片元素標準，可見梨專用肥基本滿足翠冠梨需肥要求，能較為平衡地為樹體提供針對性的營養。

果樹有機無機專用肥不僅改善了土壤理化性質和土壤養分，還進一步改善了土壤的微生物群落結構。本研究中SBF專用肥處理顯著提高了果園土壤有機質含量，同時該處理的土壤微生物OTU、Chao1、Shannon 指數均高于CF無機肥處理的，提高了土壤微生物群落多樣性，這與邵麗[21，23-24]等的研究結果基本一致。本研究中梨有機無機專用平衡肥處理的土壤中Gaiella菌的相對豐度下降，Spearman相關性分析結果表明Gaiella菌與有效氮含量呈負相關關系(表4)。研究表明土壤中硝態氮N-NO3含量上升的土壤中Gaiella菌群數量會降低[25]，這與電導率EC值成反比。梨專用肥料處理中纖維弧菌屬(Cellvibrio)的相對豐度與土壤有機質、有效氮、有效磷、速效鉀含量呈顯著正相關，其作為促進植物高效腐解的優勢菌，能通過促進土壤中的碳源快速分解而提高土壤的有機質及其他礦物質的含量[26]。總之，梨有機無機專用肥可以在一定程度上提高梨園土壤的有機質含量，提高土壤中菌群數量，為有效提高梨樹果實產量及品質提供均衡的營養。

表4 土壤元素與土壤細菌數相關性分析