基于高通量測序的坡豪湖濕地土壤細菌群落結構分析

羅奉奉，付 躍，李雪鳳，劉鑫泰，高麗霞，覃勇榮,3*

(1.河池學院 化學與生物工程學院,廣西 河池 546300;2.微生物及植物資源開發利用廣西高校重點實驗室,廣西 河池 546300;3.桂西北經濟植物生物技術研究中心,廣西 河池 546300;4.華南農業大學 生命科學學院,廣東 廣州 510000)

濕地是介于陸地生態系統和水生生態系統之間的過渡生態系統,兼具陸地和水體的生態特性,其生物多樣性非常豐富;土壤微生物作為濕地生態系統的重要生命體,對濕地物質循環、水土保持、生物多樣性保護、生態凈化等[1-4]起非常重要的作用;濕地的環境條件變化也會引起微生物群落多樣性和生態功能的改變[5-7],因此,土壤微生物作為濕地土壤亞系統變化的預警和敏感指標[8],對評估濕地生態系統資源和功能具有重要意義。

近年來隨著人為活動和環境變化的影響,眾多學者開始關注濕地生態系統的研究,主要從水文、土壤、氣候、污染物、植被等方面分析與微生物的相互關系,探索導致濕地生態穩定性變化的主要因素,這些研究認為在季節變化[9]、含水量[10,11]、土壤元素循環[12,13]、植被演替[14]、耕作方式[15,16]、重金屬污染[17]等因素的影響下,濕地土壤微生物群落多樣性呈現一定的特征性變化。

廣西東蘭坡豪湖國家濕地公園處在桂西北喀斯特石山地區的河池市東蘭縣境內,1992年在紅水河中游的巖灘水電站蓄水封閘后,在東蘭縣長樂鎮坡豪境內自然形成了湖泊濕地[18]。與其他濕地不同的是,坡豪湖濕地每年受巖灘水電站蓄放水的影響,湖泊周邊土壤常處于不同程度的湖水浸潤狀態。在2014年12月,國家林業局正式批準廣西東蘭坡豪湖國家濕地公園開展試點建設[19],旨在更好地保護坡豪湖濕地的生物多樣性。本研究根據喀斯特石山與紅水河接壤形成的坡豪湖濕地的生境特點,結合Illumina高通量測序技術從微生物生態學角度探索了坡豪湖濕地土壤細菌群落的結構變化及其與土壤環境因子、下游水庫蓄放水的關系,分析了細菌菌群在該濕地生態系統中的變化特征,旨在為坡豪湖濕地生態系統資源的保護管理和可持續利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究區域概況

研究區域為廣西河池市東蘭坡豪湖國家濕地公園(24°25′02″～24°27′14″N,107°23′53″～107°32′40″E),屬亞熱帶季風氣候,夏長冬短,雨熱同季,氣候溫和,光照充足,海拔217 m,年平均氣溫為19～21 ℃,年平均降雨量1563 mm；該公園處桂黔滇喀斯特石漠化防治生態功能區。

1.2 樣品采集

巖灘水電站蓄放水情況:每年3～9月為放水期,9月～次年3月為蓄水期。選取坡豪湖水陸交替帶(從最高水位向湖中靠近2 m位置)為試驗地,在坡豪湖周邊土壤區域按距離2～3 km選取樣地,共選8個采樣區,每個樣地設置3個樣方做平行,樣方間隔20 m,樣方大小50 cm×50 cm,按五點取樣法隨機取樣，混合為1個土樣,去除土壤中的動植物殘體和碎石等雜物,用直徑5 cm的土鉆采集距土壤表層5～20 cm的土壤,每個樣地土壤用無菌自封袋分裝成兩份,置于冰盒當天運回實驗室。一份置于-80 ℃保存,用于土壤細菌群落分析;另一份自然風干,過100目篩,用于土壤理化性質的測定。根據廣西的氣候特征,于2017年4月開始采集土壤樣品,為春季樣；隨后在7月、10月、次年1月分別采集夏、秋、冬季土壤樣品。

1.3 土壤理化性質的測定

土壤含水量(SWC)的測定采用105 ℃烘干恒重法(HJ 613─2011)；土壤pH值的測定采用電位法(HJ 962─2018)；土壤有機質含量(SOC)的測定采用重鉻酸鉀氧化-分光光度法(HJ 615─2011)；土壤全磷(TP)含量的測定采用堿熔-鉬銻抗分光光度法(HJ 632─2011)；土壤全氮(TN)含量的測定采用微量凱氏定氮法(HJ 717─2014)；土壤速效磷(AP)含量的測定采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗分光光度法(HJ 704─2014)；土壤速效氮(AN)含量的測定采用納氏比色分光光度法[20]。

1.4 土壤細菌16S rDNA的測序

采集土壤的總DNA用試劑盒(Power SoilTM DNA Isolation Kit, MOBIO, USA)提取，采用細菌通用引物338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')對16S rDNA的V3～V4高變區進行擴增,擴增產物由上海美吉生物醫藥科技有限公司進行Illumina Miseq高通量測序。

1.5 數據處理

采用Excel 2013和SPSS 26.0軟件對實驗數據進行統計整理,顯著水平確定為P<0.05。將有效序列相似性≥97%的序列劃為同一分類操作單元(OTU)；細菌的Alpha多樣性分析采用Shannon 指數、辛普森(Simpson)指數、 Chao1指數,覆蓋度(Coverage)則進行測序深度分析;對于Beta多樣性分析,利用OTUs之間的系統發生關系,采用Anosim相似性分析探索不同分組樣本間群落組成的相似性或差異性;采用RDP Classifier進行分類水平統計,用相關性熱圖進行理化指標和細菌群落關系的分析。

2 結果與分析

2.1 細菌群落多樣性分析

2.1.1 序列統計和細菌Alpha多樣性分析 經高通量測序，從坡豪湖濕地土壤8個樣地共獲得基因序列1200836條,平均長度為439.19 bp。表1顯示了8個樣地(YD1～YD8)的土壤細菌在不同季節的多樣性指數(Shannon)和豐富度指數(Chao),由表1可知：土壤細菌群落多樣性在大部分樣地中以春季最為豐富；而樣地YD1的土壤細菌多樣性以冬季最豐富,該樣地處于水陸交替帶,鴨跖草、蓮子草密度大,在冬季蓄水期該樣地不會被淹沒,因此植物生長旺盛，土壤有機質含量增加,有助于土壤微生物的生長和繁殖；樣地YD4和YD5的土壤細菌群落多樣性以夏季最豐富,這2個樣地均處于農田旁,夏季處于放水期但雨水充沛,作物根系分泌旺盛,有機質等營養物質容易被土壤微生物利用,因此土壤細菌群落的多樣性和豐度增加；此外，樣品文庫的覆蓋率(Coverage)范圍為95.4%～97.2%,能夠反映土壤微生物群落結構與多樣性的真實情況。

表1 坡豪湖濕地土壤細菌群落的豐度和多樣性

2.1.2 Beta多樣性分析 為了分析8種不同生境下的土壤細菌群落結構差異,在OTU水平上進行主成分分析,結果如圖1所示,YD1在四季中(CYD1、XYD1、QYD1、DYD1)距離相近,說明土壤OTU組成差異不大,但區別于其他樣地;夏季的YD2、YD7土壤OTU組成明顯區別于其他樣本;YD4在冬季的OTU組成區別于其在另外3個季節的;YD5在秋、冬季的土壤OTU組成明顯不同于春、夏季,但QYD5與YD6在秋、冬季的土壤OTU組成相近,DYD5與DYD8的土壤OTU組成也相近。由此說明,土壤樣本的細菌群落結構存在季節性差異,且在不同區域的樣本間也有一定的差異性。

圖中樣地名稱的首字母C、X、Q、D分別表示春季、夏季、秋季、冬季，下同。

2.2 細菌群落的物種組成分析

坡豪湖濕地土壤樣品的4105個OTUs分屬于38個門、92個綱、198個目、367個科、625個屬。由圖2可以看出，在門分類水平上,4個季節的土壤細菌群落組成有一定的相似性,但細菌類別占比有所差異,其中,變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Actinobacteria)和酸桿菌門(Acidobacteria)具有較高的占比,分別占26.83%～28.72%、15.85%～23.85%、13.80%～18.20%和13.31%～17.68%；而硝化螺菌門(Nitrospirae)和厚壁菌門(Firmicutes)所占比例分別只有5.28%～6.69%和3.02%～5.26%。變形菌門是坡豪湖濕地土壤的優勢類群,在四季占比變化不大；綠彎菌門在春、夏季的占比(22.95%～23.84%)高于秋、冬季(15.86%～17.99%)；厚壁菌門在秋、冬季的占比(4.54%～5.26%)高于春、夏季(3.01%～3.12%)，說明季節變化對這兩個細菌門的影響較大。

圖2 坡豪湖濕地土壤細菌在門水平上的分類

為了進一步分析細菌群落結構在四季中的變化差異,在屬分類學水平上進行分析,除平均豐度低于1%的部分合并為others外,共檢測出29個屬,如圖3所示。酸桿菌門下的1個綱(norank c_Acidobacteria)的相對豐度最高,占比在冬季最大(12.64%);綠彎菌門的1個厭氧繩菌科(norank f_Anaerolineaceae)和玫瑰彎菌屬(Roseiflexus)在春、夏季的占比大于秋、冬季;厚壁菌門下的芽孢桿菌屬(Bacillus)在秋、冬季的占比(3.34%～2.92%)大于春、夏季(1.50%～1.60%);變形菌門下α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)的黃色桿菌科(norank f_Xanthobacteraceae)在冬季的占比明顯增大。

圖3 坡豪湖濕地土壤細菌在屬水平上的分類

對豐富度較高的6個細菌門類群進行季節性變化的比較分析,結果如圖4所示。在春季,綠彎菌門(Chloroflexi)在YD5為優勢菌群,相對豐度為31.22%,也高于其在其他季節中的相對豐度；該樣地處于農莊附近,地勢較高,受水庫蓄放水的影響較小,主要受季節性水位變化的影響,春季雨水頻繁,形成潮間帶區,加之人為活動，影響了土壤的有機質含量,使得綠彎菌門的相對豐度較高。在夏季,變形菌門(Proteobacteria)在YD4、YD8為優勢菌群,相對豐度分別為35.12%、39.06%;綠彎菌門在YD2、YD6為優勢菌群,在夏季的相對豐度最大,分別為30.11%、28.52%。在秋季,酸桿菌門(Acidobacteria)在YD4、YD5的相對豐度最大,分別達20.65%、19.14%;厚壁菌門(Firmicutes)在YD2、YD8的相對豐度變化至最大,在YD2中從春季的1.45%升高到秋季的6.82%,在YD8中從夏季的2.34%升高到秋季的9.11%。在冬季,酸桿菌門在YD2、YD3的相對豐度最大,分別為23.48%和23.09%,為這兩個樣地的主要優勢菌群;放線菌門(Actinobacteria)在YD5的相對豐度隨季節變化而增大,在冬季最大,為23.29%；厚壁菌門在YD6的相對豐度以夏季最低,為0.96%,到冬季升至8.26%。

圖4 坡豪湖濕地土壤優勢細菌在四季的變化比較

2.3 細菌群落與土壤因子的相關性分析

由表2可知,坡豪湖濕地土壤呈弱堿性,季節性差別較大,在YD1、YD3、YD8中變化顯著(P<0.05)。SPSS 26.0 ANOVA分析表明,土壤理化指標對不同季節和不同地勢區域的樣地有明顯響應。從季節性層面看,SWC在秋、冬季顯著大于春、夏季(P<0.05),因為秋冬季是下游水庫蓄水期,大部分樣地水位提升;TP含量在YD4內部季節波動性較大,可能與其處于農田附近,受人為因素干擾有關；大部分樣地的TP含量在夏季低,因為夏季為放水期,加上降雨量增加，導致磷素流失;TN含量在冬季最高,且顯著高于夏季的(P<0.05);多數樣地的AP含量在秋季高,但YD4的AP含量在春季顯著高于其他季節的(P<0.05),YD8的AP含量在冬季顯著高于其他季節的(P<0.05);夏季在YD2中的AN含量遠超其他樣地的(P<0.05),達34.43 mg/kg;多數樣地的SOM含量在冬季高,在夏季低,因為蓄水期使有機質積累[21],但在YD6中的SOM含量在春夏季較高。

表2 坡豪湖濕地土壤理化指標的測定結果

Spearman相關性分析結果(表3、圖5、圖6)顯示：SMC為主要影響因子,與多種細菌顯著相關,其中與放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、纖維桿菌門(Fibrobacteres)均呈極顯著相關(P<0.01)，其中SMC與放線菌門呈正相關,相關系數為0.605，與綠彎菌門呈負相關,相關系數為-0.695;pH、TN、SOM、AP也與一些細菌群落呈顯著相關,其中pH與硝化刺菌門(Nitrospinae)呈極顯著正相關(P<0.01),與厚壁菌門(Firmicutes)呈顯著負相關(P<0.05);TN與擬桿菌門(Bacteroidetes)呈極顯著正相關(P<0.01),與綠彎菌門呈顯著負相關(P<0.05);SOM與螺旋體菌門(Saccharibacteria)呈顯著負相關;AP與放線菌門呈顯著正相關;TP、AN與細菌群落無顯著相關性。

圖5 坡豪湖濕地土壤細菌門分類群落與土壤化學指標的冗余分析結果

“*”表示0.01

3 討論與結論

在濕地生態系統中,微生物群落的多樣性和相對豐度受溫度、時間、空間和理化因子的多重影響。在分析微生物群落結構與環境因子間的相關性時,很難將某個環境因子獨立分開,因為微生物群落的變化與多種因子耦合作用相關[22]。坡豪湖常年受下游電站蓄放水的影響,季節性蓄放水形成水分的反復遷移影響了濕地土壤的理化環境,繼而對細菌群落的組成造成一定的影響。從細菌的多樣性和豐富度結果看,本研究區的8個樣地中土壤樣本,春夏季為水庫放水期,部分湖邊土壤水位下降,但也有些區域地勢低洼,加上春季雨水密集,形成長時間季節性淹水,如YD6在春季有機質含量最高,這與土壤的通透性較差、有機質積累有關,導致細菌多樣性和豐富度較大。本研究發現,秋冬季的SOM含量較春夏季高,可能由秋冬季受蓄水期的影響所致。水分是影響土壤性質的最主要因子[10,23-24],樣地水位高程不同導致土壤含水量、pH值、有機質含量等有明顯的差異。細菌群落變化在水位影響較明顯的樣地中呈現差別,主要集中在靠近農田區域的YD4、YD5樣地,雖然其部分區域地勢較高,受蓄放水的影響較小,但也受人類活動的干擾,因此其土壤細菌群落的多樣性和豐富度在夏季和秋季較大;YD2、YD8為桑樹種植區域,受蓄放水和耕作的影響,其土壤細菌群落的多樣性在春季最大;YD3為湖中島,蓄放水使小島邊際的水位常處于動態變化,導致春夏季的土壤細菌多樣性大于秋冬季,這與LIGI等[25]、XU等[26]、AMAUD等[27]的研究結果“在濕地生態系統中，處于不同水文條件下的土壤微生物群落結構存在著顯著差異”一致。

在本研究的樣地中,土壤主要的細菌群落有變形菌門、綠彎菌門、放線菌門、酸桿菌門、硝化螺菌門和厚壁菌門。其中變形菌門為相對豐度最高的類群,這與很多濕地土壤細菌群落研究[28-30]的結果一致,其中YD4和YD8在夏季變形菌門的相對豐度最大,這可能因為變形菌門與碳利用呈正相關[31],這兩個區域為種植區,根系利用有機質活躍,加上耕作機械擾動促進變形菌門的碳礦化速率增大,促進了作物的生長。在屬水平的物種組成中,綠彎菌門部分屬的相對豐度在春夏季增大,究其原因，雖然春夏季為放水期,但春夏季雨水頻繁,使部分地勢處于水陸交替帶,而光合自養微生物綠彎菌門常處于泥灘帶,能提供大量的生產力[32],這也間接說明水分在樣地中對綠彎菌門菌群的影響較大；厚壁菌門的芽孢桿菌屬在秋冬季的相對豐度大于春夏季,其中在YD2、YD6、YD8中從春季到冬季豐度呈明顯的增大趨勢,可能與其形成可逆性強的芽孢有關,WANG等[32]在對海洋沉積物、淡水和潮間帶沉積物微生物群落的研究中發現厚壁菌門的芽孢桿菌綱豐度較高,其產芽孢具有極強的環境適應能力。

相關性分析發現,土壤水分對綠彎菌門和放線菌門具有極顯著的影響,綠彎菌門的相對豐度在YD5中春季最高,在YD2和YD6中夏季較高,因為這3類樣地受季節性蓄放水的影響較大,這與物種組成的研究結果一致,再次證明綠彎菌門的相對豐度與土壤的水分含量相關。放線菌門的相對豐度在YD5中冬季增大,而該樣地在冬季的土壤含水量較高，這與放線菌適于在干燥、高溫環境下生長[33]相悖,因此其豐度增大可能還與該區域的人為因素影響有關,生活污水及垃圾的排放和堆積致使放線菌門菌群數量增加,有研究發現在污染石油、多環芳烴(PAHs)及有機物等環境中放線菌門的相對豐度增加[34-36],與其降解污染物的能力相關[37,38]。酸桿菌門的相對豐度在YD2、YD3中冬季升至最大,因為這2個樣地受人為耕作和牲畜因素的干擾,土壤有機質容易被分解,這與相關研究[39-41]的結果“酸桿菌門喜歡低營養組環境”一致。有研究認為土壤酸桿菌門的豐度與pH值成反比[31]；但Zhang等[44]認為大多數細菌門的相對豐度在近中性土壤中高于在酸性或堿性土壤中,其中酸桿菌門也屬優勢菌門,本研究結果則與其一致。由此看出,環境因素對濕地土壤微生物分布的影響很大,因坡豪湖濕地受水庫的影響,其土壤細菌多樣性呈季節性變化，維系物質循環,但同時湖邊部分區域受耕作或污染因素的干擾,使得一些菌群的組成變化與人類活動因素相關。因此從保護濕地的生態功能考慮,應盡量控制和減少人為不利干擾的影響,以改善土壤微生物群落的結構和土壤結構。