液相色譜串聯質譜法對原發性醛固酮增多癥的診斷價值

程子韻， 陸志強

復旦大學附屬中山醫院內分泌科，上海 200032

原發性醛固酮增多癥(primary aldosteronism，PA)是已知的繼發性高血壓中的最常見病因，在1、2、3級高血壓患者中的患病率分別為1.99%、8.02%和13.2%，而在難治性高血壓患者中高達17%～23%[1-3]。PA的診斷主要分為疾病篩查、確診試驗及分型3個步驟，對于篩查試驗陽性的患者需進一步行確診試驗來明確診斷。

目前常用于PA篩查和確診的檢測方法是以免疫技術為基礎的放射免疫法或化學發光法，但免疫法準確性差、存在交叉干擾。液相色譜串聯質譜(liquid chromatography tandem mass spectro-metry，LC-MS/MS)具有靈敏度高、特異度高等優點，正逐漸應用于臨床，但其在PA篩查和確診中尚無統一的診斷標準。我國指南目前推薦的生理鹽水抑制試驗(saline infusion test，SIT)診斷標準與國外一致，而卡托普利試驗(captopril test，CCT)推薦的診斷指標與美國指南存在差異，上述結論均基于免疫法檢測結果推導而出[4-5]。本研究旨在探討LC-MS/MS測定下SIT和CCT對PA的診斷價值及最佳診斷截斷值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 回顧性選取2018年2月至2019年2月復旦大學附屬中山醫院內分泌科收治入院的高血壓患者127例，年齡18～80歲。納入標準：(1)持續性高血壓(3次非同日測定血壓>150/100 mmHg，1 mmHg=0.133 kPa)、難治性高血壓(聯合使用包括利尿劑在內的3種降壓藥物，血壓大于140/90 mmHg；或聯合使用4種及以上降壓藥物，血壓<140/90 mmHg)；(2)高血壓合并自發性或利尿劑所致低鉀血癥；(3)高血壓合并腎上腺意外瘤；(4)具有早發性高血壓家族史或早發(<40歲)腦血管意外家族史；(5)患高血壓且一級親屬中存在PA家族史患者；(6)高血壓合并阻塞性呼吸睡眠暫停。排除標準：(1)其他繼發性高血壓病因患者，如腎性高血壓、腎動脈狹窄、嗜鉻細胞瘤、庫欣綜合征等；(2)慢性腎功能不全患者(估計腎小球濾過率<70 mL·min-1·1.72 m-2)；(3)嚴重心肺疾病患者(呼吸衰竭、心功能不全3級以上)；(4)肝功能不全、肝衰竭患者(肝臟轉氨酶升高超過正常上限2倍)；(5)妊娠或目前正在應用性激素、糖皮質激素治療患者。本研究經復旦大學附屬中山醫院倫理委員會批準(2010-70)，所有患者均知情并簽署知情同意書。

1.2 檢測前準備 檢測前停用對激素檢測結果存在影響的藥物，包括利尿劑、血管緊張素轉換酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑、二氫吡啶類鈣離子通道阻滯劑和甘草制劑。其中利尿劑及甘草制劑檢查前停用4周，其余藥物停用2周。

1.3 激素檢測方法 以核素氘為內標，以甲醇和水作為流動相，采用CORTEX C18色譜柱進行分離，采用Xevo TQS ACQUITY UPLC System儀器(Waters公司，美國)檢測血漿醛固酮濃度(plasma aldosterone concentration，PAC)。以arginine13C15N為內標，甲醇水溶液和甲酸甲醇溶液作為流動相，采用Phenomenex Kinetex C18色譜柱進行分離，采用QTRAP○R6500(SCIEX公司，美國)儀器檢測腎素活性(plasma renin activity，PRA)。PAC的檢測線性范圍為25～2 000 pg/mL，定量檢出下限為12.5 pg/mL，批內和批間不精密度的變異系數(coefficient of variation，CV)分別為<6%和小于10%。建立的PAC生物參考區間為21～211.6 pg/mL(立位)。PRA的檢測線性范圍為0.028～10.000 ng·mL-1·h-1，定量檢出下限為0.028 ng·mL-1·h-1，批內和批間不精密度的CV均小于15%。建立的PRA生物參考區間為0.25～5.12 ng·mL-1·h-1(立位)。2種方法通過性能驗證，能有效應用于臨床。

1.4 其他相關檢查 于6∶00采集患者空腹靜脈血，檢測肝腎功能、電解質、空腹血糖、血脂等指標。

1.5 CCT和SIT方法 (1)CCT：患者于8∶00口服卡托普利25 mg，服藥前靜臥30 min，分別于服藥前0 min、服藥后1 h、服藥后2 h，采用EDTA抗凝管抽取靜脈血測PAC和血漿腎素活性(plasma renin activity，PRA)水平。在整個試驗過程中患者保持坐位或平臥位。(2)SIT：試驗于8∶00至9∶30間開始，試驗前30 min及試驗期間患者均保持平臥位，于4 h內連續靜脈滴注0.9%生理鹽水2 000 mL。于試驗前0 min和生理鹽水滴注4 h后，采用EDTA抗凝管抽取靜脈血測PAC和PRA水平。

1.6 診斷標準 PA診斷金標準包括2項，滿足其中任意1項即可確診。(1)螺內酯口服試驗：對于疑似PA患者予螺內酯80 mg tid口服治療，并于門診持續隨訪，逐漸減少其他抗高血壓藥物至停用。若患者口服螺內酯后，高血壓得到明顯控制，同時低鉀血癥得到改善，則確診PA；(2)手術切除：若雙側腎上腺靜脈采血提示患者腎上腺存在單側醛固酮優勢分泌，則予以手術切除單側腎上腺，術后隨訪患者血壓、血鉀變化情況，若患者癥狀明顯好轉則確診為PA。

2 結 果

2.1 一般資料分析 結果(表1)顯示：通過安體舒通試驗及手術治療確診PA患者57例，其中男性31例，女性26例，平均年齡(53.67±12.02)歲。原發性高血壓(essential hypertension，EH)組患者70例，其中男性32例，女性38例，平均年齡(52.70±13.55)歲。2組患者年齡、性別、體質指數、高血壓病程、血壓值等差異均無統計學意義。PA組患者的血鉀水平低于EH組，而血鈉及24 h尿鉀較EH組升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表1 2組患者的一般資料比較

2.2 試驗前后PAC和PRA變化情況 結果(表2)顯示：CCT和SIT試驗前，PA組的PAC均明顯高于EH組，PRA均明顯低于EH組，差異有統計學意義(P<0.001)。在PA組和EH組中，CCT和SIT試驗后的PAC和醛固酮/腎素比值(aldosterone/renin concentration ratio，ARR)較試驗前均下降(P<0.001)。

表2 CCT和SIT試驗前后患者PAC、PRA和ARR的水平變化情況

2.3 CCT的診斷價值和最佳診斷截斷值 結果(圖1)顯示：CCT試驗后PAC、ARR及PAC抑制率對應的AUC分別為0.876(95%CI 0.804～0.948)、0.902(95%CI 0.846～0.959)和0.751(95%CI 0.659～0.842)。三者相比，試驗后ARR的診斷價值最高。當ARR=6.5時，YI值達到最大，診斷靈敏度為94.2%，特異度為78.0%。若以試驗后PAC絕對值為診斷指標，PAC=34.8 pg/mL時診斷特異度可升至93.2%，但診斷的靈敏度降至75.5%。CCT中不同指標的診斷價值見表3。

圖1 CCT診斷價值的ROC曲線

表3 CCT中不同指標的診斷截斷值和診斷價值

2.4 SIT的診斷價值和最佳診斷截斷值 結果(圖2、表4)顯示： SIT后PAC、ARR及PAC抑制率對應的AUC分別為0.881(95%CI 0.810～0.952)、0.823(95%CI 0.738～0.909)和0.652(95%CI 0.544～0.760)。SIT后PAC的診斷效率最高，PAC截斷值為24 pg/mL時YI達到最大，診斷靈敏度為87.2%，特異度為78.8%。

圖2 SIT診斷價值的ROC曲線

表4 SIT中不同指標的診斷截斷值和診斷價值

2.5 CCT和SIT聯合診斷的價值 同時完成CCT和SIT的患者84例，若以CCT后ARR>6.5、SIT后PAC>24 pg/mL作為PA的診斷標準，設定滿足其中之一即考慮為PA，則在84例患者中漏診2例，但誤診患者增加至15例，靈敏度和特異度分別為97.7%和82.2%。若以CCT后PAC>34.8 pg/mL、SIT后PAC>24 pg/mL作為診斷標準，則在84例患者中漏診4例，誤診9例，靈敏度和特異度分別為95.3%和89.3%。

3 討 論

醛固酮是腎上腺皮質分泌的類固醇激素之一，由血液中的膽固醇經過一系列酶促反應合成。醛固酮在血液循環中的含量低至以pg/mL為單位，精確檢測存在困難。傳統檢測包括放射免疫法和化學發光法[6-7]，但由于與醛固酮代謝物及其他類固醇激素存在交叉反應，這2種方法在檢測結果上都存在較大數據變異性，采用不同廠商和試劑檢測得到的結果缺乏可比性[8-9]。腎素檢測目前包括PRA和血漿腎素濃度2種方式。直接測定血漿腎素濃度更具成本和時間效益，但其與腎素原產生的交叉反應可導致結果假陽性，此外還易受到雌激素的影響，檢測時需注意避開女性經期[10]。而通過放射免疫法測PRA也存在免疫交叉干擾、線性窄、核素污染等問題，同時孵育時間、pH和酶抑制劑的選擇對PRA結果也會造成影響[11]。LC-MS/MS檢測可避免檢測時的交叉反應，具有更高的檢測靈敏度和特異度，正逐漸取代免疫法成為類固醇激素檢測的金標準[12-13]。

美國內分泌學會2016年指南推薦的PA確診試驗包括4種試驗，受限于試驗用藥和臨床操作，國內目前開展較多的是SIT和CCT。CCT試驗操作簡便，不會增加循環容量負荷，不良反應小，當患者患有難以控制的高血壓或嚴重心功能不全時可作為首選試驗。正常人進行CCT時，作為血管緊張素轉換酶抑制劑的卡托普利抑制了體內醛固酮生成，導致PAC降低。CCT診斷性能在東西方人群中的結果不一，Rossi等[14]在1 125例患者中篩查出317例陽性患者并進行CCT，結果發現，PAC取385 pmol/L(即13.9 ng/dL)時診斷價值最大，診斷靈敏度和特異度為69.6%和74%。我國和日本文獻[15-17]報道的CCT診斷性能較西方高，試驗后PAC診斷截斷值為11～25 ng/dL，亦有研究[18]認為以試驗后ARR作為診斷指標時的診斷性能更佳。從指南角度出發，美國指南[4]認為非PA患者在CCT后的PAC抑制率應大于30%，我國[5]和日本指南[19]推薦的診斷截斷值則分別為11 ng/dL和12 ng/dL。本研究共對111例患者進行CCT，結果發現，當試驗后ARR取6.5時診斷性能最佳，此時在52例PA患者中漏診3例，59例EH組患者中誤診13例。同時，當試驗后PAC截斷值為34.8 pg/mL(即3.48 ng/dL)時，診斷的特異度達93.2%，由于確診試驗較疾病篩查更需避免誤診，也可將CCT后PAC作為診斷標準截斷值。

SIT是目前應用最為廣泛的PA確診試驗，但該試驗導致患者短時間內的血容量明顯增加，可能誘發血壓劇烈升高、心力衰竭、電解質紊亂等，在心功能不全、嚴重低鉀血癥的患者中應謹慎使用。大部分研究均認可將試驗后PAC作為診斷指標，但所得出的最佳截斷值及診斷價值存在較大差異。針對西方人群的研究[20-22]得出的截斷值多為6～7 ng/dL，美國指南推薦SIT后PAC>10 ng/dL可確診PA，<5 ng/dL時排除PA。有研究[4,15,17,23]表明，針對中國人群研究得到的最佳截斷值較西方國家偏高，SIT后PAC最佳截斷值波動在8～14.5 ng/dL。另外，SIT試驗具備一定的假陰性率。在一項以雙側腎上腺靜脈采血為診斷金標準的小樣本研究[24]中，SIT后PAC截斷值為5 ng/dL時，漏診率為29%，而當截斷值取10 ng/dL時，漏診率升至37%。本研究對101例患者進行了SIT，其中2例因血壓過高終止試驗，總體認為SIT較安全。同樣對試驗后PAC、ARR和PAC抑制率3個指標的分析結果提示，試驗后PAC診斷價值高于其他指標。當截斷值取24 pg/mL(2.4 ng/dL)時，靈敏度和特異度分別為87.2%和78.8%。

目前不同文獻報道的PA診斷截斷值存在明顯差異，造成差異的部分原因是研究人群及研究方案設計不同，如部分研究中使用氟氫可的松試驗作為診斷金標準，但試驗自身也存在一定的假陽性與假陰性率。在各種影響因素中，檢測技術對試驗結果的準確性和可靠性至關重要。本研究基于LC-MS/MS技術探討PA確診試驗的診斷價值和截斷值，結果較指南和既往文獻推薦的數值均明顯降低，這可能與本研究采用的檢測方法為LC-MS/MS有關。既往研究[25]發現，LC-MS/MS檢測下的PAC水平較放射免疫法降低約30%。同時需要注意的是，在進行CCT的111例患者中，66%的患者試驗前的PAC小于100 pg/mL，基礎PAC水平對結果會造成一定影響，而本研究中試驗后PAC抑制率的診斷價值偏低同樣也可能與此相關。同時本研究發現，CCT和SIT聯合試驗可進一步提高診斷效率，考慮到確診試驗對特異度要求較高，建議將CCT后PAC和SIT后PAC作為聯合試驗的診斷指標。

綜上所述，CCT試驗后ARR和PAC均可作為PA的診斷指標，診斷截斷值為6.5 pg/mL和34.8 pg/mL；SIT后PAC的診斷截斷值為24 pg/mL。隨著質譜技術的不斷普及，未來還需針對LC-MS/MS技術診斷PA進行更加深入的臨床研究。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。