氨基酸對阿維菌素生物合成的影響

王文亮，郭佳(寧夏泰益欣生物科技有限公司，寧夏 銀川 750205)

0 引言

阿維菌素是一個十六元環內酯與一個二齊墩果糖結合生成的大環內酯類抗生素，因其具有廣譜、高效和低毒的殺蟲效果，在國內農業及醫藥行業具有廣闊的應用前景，同時，也是我國主要的出口產品之一，在國外市場中也占據重要的地位。阿維菌素的發酵產物具有8種同分異構體，其中以B1a的抗菌殺蟲效果最佳[1]。近年來，阿維菌素的研究較為廣泛，涉及到阿維菌素高產菌種的選育、發酵工藝的優化及阿維菌素生物合成過程控制等研究，傳統的育種或工藝優化已難以滿足企業提升阿維菌素發酵產量需求，但阿維菌素生物合成過程中前體物質的添加將是一個研究熱點[2]。

阿維菌素是由鏈霉菌中阿佛曼菌(Streptomyces avermitilis) 發酵產生大環內脂類化合物。1975年，日本Kitasato Institute (北里大學)大村智教授研究土壤微生物時，分離獲得一株阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis MA-4680)，研究其活性發現該菌株的發酵液具有殺蟲、殺螨、殺線蟲、驅腸道寄生蟲的活性，且對哺乳動物的毒性較低，即使將發酵液濃縮后，藥物的濃度提升為原來的8倍，也無至毒效果[4]。1976年美國Merck公司經對阿維菌素發酵液研究，分離獲得一組十六元大環內酯類化合物，將它命名為Avermectin，中文名阿維菌素、或稱阿弗菌素或埃維菌素。阿維菌素的發現及應用是繼青霉素以來抗生素科學對人類的又一巨大貢獻，對全世界的農牧業生產起到了巨大的促進作用[3]。

其生物合成是以乙酸、丙酸等簡單有機化合物開始的，目前，已有報道顯示纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸及丙酸鈉等物質均為阿維菌素合成過程中重要的前體物質。劉釔君等將丙酸鈉和異亮氨酸添加至阿維菌素發酵瓶培養基中，結果顯示兩種添加物均不利于阿維菌素的生物合成，并且對阿維菌素發酵液的pH和菌濃均產生了一定影響。吳暉等研究發現丙酸鈉比乙酸鈉更適合作為阿維菌素合成的前體物質，有利于提升阿維菌素的生產能力[5]。因此本研究主要考察纈氨酸、亮氨酸及異亮氨酸等氨基酸對阿維菌素發酵產量的影響。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

YP4002電子天平(上海越平科學儀器有限公司)，XDW25搖瓶機(江蘇同君儀器科技有限公司)，waters2487型HPLC(江蘇塞恩斯科技有限公司)。

1.2 試劑

黃豆餅粉、玉米淀粉(寧夏泰益欣生物科技有限公司)，纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸(河南冠琪生物科技有限公司)，硫酸銨、碳酸鈣、氯化鈷、硫酸錳、鉬酸鈉(天津市凱通化學試劑有限公司，化學純)。

2 材料與方法

2.1 菌種來源

本試驗菌種阿弗曼菌(Streptomyces avermitilis)，由寧夏泰益欣生物科技有限公司提供。

2.2 試驗方法

2.2.1 溶液配制

稱取一定量的化學純纈氨酸、亮氨酸及異亮氨酸置于燒杯中加入少量的純化水，水浴加熱用純化水進行溶解阿維菌素的發酵培養。

2.2.2 阿維菌素含量測定

采用HPLC法測定發酵液中阿維菌素的含量，條件為：C18色譜柱(4.6×150 mm，5 μm)，流速1.0 mL/min，檢測波長246 nm，流動相為甲醇∶水=9∶1。

3 結果與分析

3.1 三種氨基酸對阿維菌素生物合成的影響

大環內脂類抗生素的合成一般都是由一些氨基酸作為前體物質進行合成的，因此加入一定量的前體物質有助于產物的合成，本研究在發酵培養基中添加三種10 mmol/ L 前體物質纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸，與不加任何前體物質的普通培養基對照培養，然后用同一瓶種子液轉發酵，在適宜的條件下進行培養11 d后測定阿維菌素發酵單位。

如圖1所示，三種前體物質的添加均對阿維菌素發酵單位均有一定的影響，能提升阿維菌素的發酵單位，添加10 mmol/ L 的前體物質，分別高于對照3.89%、2.47%和1.29%。因此，這三種氨基酸對阿維菌素具有提升化學效價的作用。

圖1 三種氨基酸對阿維菌素生物合成的影響

3.2 不同氨基酸在不同濃度下對阿維菌素發酵單位的影響

在阿維菌素發酵搖瓶培養基中添加不同濃度的氨基酸，將3中氨基酸配制成不同濃度的水溶液，分別在發酵培養基 中 添 加0 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L、60 mmol/L、80 mmol/L濃度的氨基酸，培養11 d后取樣測定阿維菌素的化學效價，結果如圖2所示。

圖2 不同氨基酸在不同濃度下對阿維菌素發酵單位的影響

從上圖中可以看出纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸對阿維菌素的生物合成均具有不同程度的影響，其中纈氨酸和亮氨酸對阿維菌素的發酵單位具有積極的影響，不同濃度下實驗組的發酵單位高于對照組；添加濃度為10 mmol/L時三種氨基酸的實驗組均高于對照。但添加濃度提升20 mmol/L時異亮氨酸就對阿維菌素的生物合成產生了抑制作用；纈氨酸對阿維菌素的生物合成影響最大，當纈氨酸的添加濃度為20 mmol/L時，化學效價達到了峰值為7 200 u/mL左右，高出對照組400個效價單位。表明纈氨酸和低濃度的亮氨酸可作為前體物質進行添加，從而提升化學效價單位。

3.3 氨基酸對不同周期發酵液的影響

經過以上對氨基酸濃度及種類進行篩選，確定出纈氨酸在20 mmol/L的濃度下對阿維菌素的發酵單位具有較好的影響，而亮氨酸在30 mmol/L時對阿維菌素的生物合成具有較大的影響，分別配制纈氨酸20 mmol/L和亮氨酸30 mmol/L的濃度，發酵瓶培養過程中每隔24 h測定發酵瓶前中期的pH、菌濃和發酵效價單位。

如圖3所示，在配制培養基的過程中添加一定濃度的纈氨酸和亮氨酸，在發酵培養前期對阿維菌素的生物合成具有一定影響，添加纈氨酸后可以有效提升阿維菌素的發酵單位，高于對照組500個效價單位；添加亮氨酸后，在120 h前實驗組的發酵效價高于對照組，隨著培養周期的延長，實驗組的化學效價漲幅下降，最終發酵效價低于對照組。表明亮氨酸對阿維菌素的前期合成具有促進作用，而纈氨酸對阿維菌素發酵效價具有明顯的提升作用。

圖3 氨基酸度不同周期發酵液的影響

4 結語

本研究以纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸作為添加前體物質，添加至阿維菌素的發酵培養基中，考察這三種氨基酸對阿維菌素發酵單位的影響，結果表明，纈氨酸可以有效提升阿維菌素的發酵效價單位；異亮氨酸在阿維菌素發酵前期對阿維菌素的合成無明顯影響；而亮氨酸在阿維菌素前期的生物合成中具有促進作用，后期培養過程中導致阿維菌素效價單位低于對照組，具體原因需進一步研究。