地理分布與烏藥藥材品質“道地性”的相關性分析

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1.浙江中醫藥大學藥學院 杭州 311402 2.寧波市婦女兒童醫院

烏藥（Linderae Radix）系樟科植物烏藥（Lindera aggregata（Sims） Kosterm.）的干燥根，現主要分布于浙江天臺、衢州，江西景德鎮、撫州、新余，湖南懷化、邵陽和四川巴中等地區。現代藥理研究顯示，烏藥具有調節胃腸道功能的作用[1]。天臺被認為是烏藥的道地產區，天臺烏藥的藥材品質和療效與其他產地烏藥相比有著顯著的優勢，這種優勢或稱為“道地性”是否與其生長的地理環境及由此產生的活性成分差異相關，目前尚未得知。研究表明，產地不同、生長的環境存在差異，可引起藥材性狀及所含有效成分的改變，進而影響藥材的有效性[2-3]。特征性、指標性成分含量的高低是評價藥材品質好壞的重要標準；而藥材的顯微特征觀察示例可用于中藥真偽鑒定和藥材優劣評價，是道地藥材鑒別的有效方法[4-5]。烏藥醚內酯與去甲異波爾定是烏藥的法定檢測指標[6]，其中烏藥醚內酯亦是其特征性成分[7]。本研究采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC） 法檢測道地與非道地產區烏藥去甲異波爾定、烏藥醚內酯2個主要成分的含量并觀察藥材顯微特征，探討地理分布與烏藥藥材“道地性”的相關性，尋找道地產區烏藥的獨特綜合性指標，擬闡釋烏藥“道地性”的科學內涵[8]，為烏藥進一步開發利用提供參考。

1 儀器和材料

1.1 材料 去甲異波爾定對照品、烏藥醚內酯對照品均購于上海源葉生物科技有限公司 （批號：P10M9L61140、ZJ0630BA14）；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）均購于O-ceanpak公司（批號：20111102G108、20111027G108）；甲醇（分析純）、甲酸（分析純）、鹽酸（分析純）均購于國藥集團化學試劑有限公司（批號：20200928、20160516、20191216）；甲酸（色譜純）購于Aladdin公司（批號：E2022005）。浙江天臺、湖南懷化產地烏藥藥材由浙江中醫藥大學中藥飲片廠提供，浙江衢州、江西景德鎮、湖北恩施產地烏藥藥材由寧波市鄞州醫藥藥材有限公司提供，云南楚雄產地烏藥藥材由云南螺螄灣藥材批發市場采購，天臺烏藥樣品在產地經刮皮處理，余產地樣品為原藥材干燥后所切飲片。

1.2 主要儀器 LC-20A型島津高效液相色譜儀購于日本島津公司；BSA224S型Sartorius電子天平為德國Sartorius公司產品；XS105DU型電子天平購于瑞士Mettler Toledo公司；SB-5200D超聲波清洗機購于寧波東南儀器有限公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱購于上海精宏實驗設備有限公司；DM500正置顯微鏡為徠卡儀器（德國）有限公司產品。

1.3 烏藥醚內酯、去甲異波爾定含量測定

1.3.1 色譜條件

1.3.1.1 烏藥醚內酯含量測定 Silversil C18柱（4.6nm×250nm，5μm），流動相乙腈:水（56:44），柱溫30℃；流速1.0mL·min-1，檢測波長235nm，進樣量10μL，理論塔板數不低于2 000。

1.3.1.2 去甲異波爾定含量測定 Silversil C18柱（4.6nm×250nm，5μm），流動相為乙腈（A）:含0.5%甲酸、0.1%三乙胺溶液（B），梯度洗脫（0～13min，10%～22%A，13～22min，22%A），柱溫30℃，流速1.0mL·min-1，檢測波長280nm，進樣量10μL，理論塔板數不低于5 000。

1.3.2 對照品溶液的制備

1.3.2.1 烏藥醚內酯對照品溶液的制備 精密稱取烏藥醚內酯對照品7mg，稱定質量，置于50mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容，得0.144mg·mL-1的烏藥醚內酯對照品溶液。

1.3.2.2 去甲異波爾定對照品溶液的制備 精密稱取去甲異波爾定對照品11mg，稱定質量，置于50mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容，得0.220mg·mL-1的去甲異波爾定對照品溶液。

1.3.3 供試品溶液的制備

1.3.3.1 烏藥醚內酯含量測定供試品溶液制備 精密稱取烏藥粉末0.250g，過3號篩，置于25mL具塞錐形瓶中，加甲醇至刻度，超聲1h，冷卻，以甲醇補足至刻度線，過0.45μm微孔濾膜，即得烏藥醚內酯供試品溶液。

1.3.3.2 去甲異波爾定含量測定供試品溶液制備 精密稱取烏藥粉末0.100g，過3號篩，置于具塞錐形瓶中，以移液管移取甲醇-鹽酸（0.5→100）（2:1）25mL，稱定質量，加熱回流并保持微沸1h，冷卻，再稱定并補足質量，搖勻，取續濾液，過0.45μm微孔濾膜，即得去甲異波爾定供試品溶液。

1.3.4 精密度考察

1.3.4.1 烏藥醚內酯精密度考察 精密稱取同一批次烏藥粉末，按照1.3.3.1項條件提取，1.3.1.1項色譜條件進樣，連續進樣6次，記錄各峰面積（mAU×min），計算6次進樣峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）值。

1.3.4.2 去甲異波爾定精密度考察 精密稱取同一批次烏藥粉末，按照1.3.3.2項條件提取，1.3.1.2項色譜條件進樣，連續進樣6次，記錄各峰面積（mAU×min），計算6次進樣峰面積的RSD值。

1.3.5 穩定性考察

1.3.5.1 烏藥醚內酯穩定性考察 精密稱取同一批次烏藥粉末，按照1.3.3.1項條件提取，1.3.1.1項色譜條件進樣，分別在0、4、8、12、16、20、24h檢測并記錄各峰面積（mAU×min），計算7次進樣峰面積的RSD值。

1.3.5.2 去甲異波爾定穩定性考察 精密稱取同一批次烏藥粉末，按照1.3.3.2項條件提取，1.3.1.2項色譜條件進樣，分別在0、4、8、12、16、20、24h檢測并記錄各峰面積（mAU×min），計算7次進樣峰面積的RSD值。

1.3.6 重復性考察

1.3.6.1 烏藥醚內酯重復性考察 精密稱取同一批次烏藥樣品6份，按照1.3.3.1項條件提取，1.3.1.1項色譜條件進樣，記錄各峰面積（mAU×min），計算含量及其RSD值。

1.3.6.2 去甲異波爾定重復性考察 精密稱取同一批次烏藥樣品6份，按照1.3.3.2項條件提取，1.3.1.2項色譜條件進樣，記錄各峰面積（mAU×min），計算含量及其RSD值。

1.3.7 線性方程考察

1.3.7.1 烏藥醚內酯線性方程考察 精密吸取原濃度的烏藥醚內酯對照品溶液1、2、4、6、10mL至10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，分別制成濃度為0.0144、0.0288、0.0576、0.0864、0.1440mg·mL-1的對照品溶液，準確吸取上述對照品溶液10μL，按1.3.1.1項色譜條件進行測定。以濃度為橫坐標（x，單位mg·mL-1），峰面積為縱坐標（y，單位mAU×min），繪制標準曲線，得到回歸方程。

1.3.7.2 去甲異波爾定線性方程考察 精密吸取原濃度去甲異波爾定對照品溶液1、2、4、5、10mL至10mL容量瓶中，加甲醇-鹽酸（0.5→100）（2:1）至刻度，搖勻，超聲至完全溶解，分別制成濃度為0.0220、0.0440、0.0880、0.1100、0.2200mg·mL-1的對照品溶液，準確吸取上述對照品溶液10μL，按1.3.1.2項色譜條件進行測定。 以濃度為橫坐標（x，單位mg·mL-1），峰面積為縱坐標（y，單位mAU×min），繪制標準曲線，得到回歸方程。

1.3.8 加樣回收率考察

1.3.8.1 烏藥醚內酯加樣回收率考察 精密稱取已知含量的天臺烏藥0.125g，加入一定量的烏藥醚內酯對照品，按照1.3.3.1項的方法制備溶液，進樣10μL，以1.3.1.1項色譜條件進行測定，測定峰面積，計算回收率，實驗重復6次。

1.3.8.2 去甲異波爾定加樣回收率考察 精密稱取已知含量的天臺烏藥0.050g，加入一定量的去甲異波爾定對照品，按照1.3.3.2項的方法制備溶液，進樣10μL，以1.3.1.2項色譜條件進行測定，測定峰面積，計算回收率，實驗重復6次。

1.3.9 含量測定

1.3.9.1 烏藥醚內酯含量測定 精密稱取6個不同產地的烏藥0.250g，分別按1.3.3.1項的方法制備供試品溶液，進樣10μL，以1.3.1.1項色譜條件進行測定，記錄色譜峰面積，計算烏藥醚內酯含量，重復2次。

1.3.9.2 去甲異波爾定含量測定 精密稱取6個不同產地的烏藥0.100g，分別按1.3.3.2項的方法制備供試品溶液，進樣10μL，以1.3.1.2項色譜條件進行測定，記錄色譜峰面積，計算去甲異波爾定含量，重復2次。

1.4 不同產地烏藥與天臺烏藥主成分含量差異比較 對比5個產地的烏藥中的主成分烏藥醚內酯、去甲異波爾定含量，分別按下式計算相對天臺烏藥的含量差異比。含量差異比（%）=（天臺烏藥主成分含量-其他產地烏藥主成分含量）/天臺烏藥主成分含量×100%。

1.5 不同產地經緯度查詢 通過百度網站查詢，拾取坐標系統檢索不同產地的經緯度。

1.6 顯微觀察性狀特征 取6個不同產地的烏藥，打粉過3號篩，取粉末適量，滴加甘油醋酸進行顯微觀察。

2 結果

2.1 精密度考察結果 計算得出，烏藥醚內酯、去甲異波爾定RSD值分別為0.68%、0.03%，說明該測定方法的精密度良好。

2.2 穩定性考察結果 計算得出，烏藥醚內酯、去甲異波爾定RSD值分別為0.36%、0.64%，說明樣品至少在24h內穩定。

2.3 重復性考察結果 計算得出，烏藥醚內酯、去甲異波爾定RSD值分別為0.52%、2.22%，說明該測定方法的穩定性良好。

2.4 線性方程考察結果 烏藥醚內酯在0.0144～0.1440mg·mL-1濃度范圍內線性擬合的標準曲線回歸方程為y=906 471.4612x-1 150.7671（r2=1），去甲異波爾定在0.0220～0.2200mg·mL-1濃度范圍內線性擬合的標準曲線回歸方程為y=12 958 444.1900x+5 552.8778（r2=0.9997），說明該測定方法線性關系良好。

2.5 加樣回收率考察結果 烏藥醚內酯回收率RSD值為0.57%，加樣回收率98.70%～100.30%；去甲異波爾定回收率RSD值為2.22%，加樣回收率97.20%～103.90%，說明該方法的加樣回收率符合要求。見表1、2。

表1 烏藥醚內酯加樣回收試驗結果Tab.1 Determination results of the recovery rate of linderane

表2 去甲異波爾定加樣回收試驗結果Tab.2 Determination results of the recovery rate of norisoboldine

2.6 含量測定結果 計算得出6個不同產地烏藥中烏藥醚內酯、去甲異波爾定的含量，并換算成質量分數。見表3。浙江天臺烏藥中所含烏藥醚內酯明顯高于其他產地。各產地烏藥醚內酯含量比例為浙江天臺∶浙江衢州∶湖北恩施∶江西景德鎮∶湖南懷化∶云南楚雄=67∶45∶40∶25∶20∶1， 去甲異波爾定含量比例為浙江天臺:浙江衢州:湖北恩施:江西景德鎮:湖南懷化:云南楚雄=62:75:84:65:59:1。

表3 不同產地烏藥主要成分含量測定及地理分布Tab.3 Assay of main components and geographical distribution of Linderae Radix from different regions

2.7 不同產地烏藥與天臺烏藥主成分含量差異比較 計算得出，其他產地相對天臺產地的烏藥醚內酯含量差異比，浙江衢州、湖北恩施、江西景德鎮、湖南懷化、云南楚雄分別為32.80%、41.50%、62.70%、70.70%、98.50%；而其他產地相對天臺產地的去甲異波爾定含量差異比，浙江衢州、湖北恩施、江西景德鎮、湖南懷化、云南楚雄分別為22.00%、35.70%、4.90%、3.60%、98.40%。說明與天臺比較，各產地所產烏藥的去甲異波爾定含量相對接近，而烏藥醚內酯含量差異比較大，適合作為不同產地品質的評價指標。

2.8 不同產地經緯度查詢結果 浙江天臺與浙江衢州、江西景德鎮三個產地經度、緯度相近；湖北恩施與湖南懷化兩者經度相近；云南楚雄與其他5個產地經度、緯度存在顯著差異。見表3。

2.9 不同產地烏藥性狀特征顯微觀察 顯微觀察各個產地烏藥粉末顆粒性狀特征提示，浙江天臺、浙江衢州、江西景德鎮三者顯微特征較相似，淀粉粒、油細胞常見，浙江天臺、江西景德鎮未見糊化淀粉粒；湖北恩施與湖南懷化兩者顯微特征較相似，均含有大量糊化淀粉粒，少量石細胞，較少的油細胞和淀粉粒，木纖維中淀粉粒較少；云南楚雄與其他5個產地烏藥顯微差異顯著，其淀粉粒極多，多呈團簇狀，木纖維中淀粉粒常見并且顆粒較大，油細胞較少。見表4及圖1～7。

表4 不同產地烏藥粉末顯微性狀特征Tab.4 Characteristics of microscopic properties of Linderae Radix powder from different regions

圖1 不同產地烏藥淀粉顯微特征（40×）Fig.1 Microstructure of starch granules Linderae Radix from different regions

圖2 不同產地烏藥導管顯微特征（40×）Fig.2 Microstructure of starch catheters of Linderae Radix from different regions

圖3 不同產地烏藥韌皮纖維顯微特征（40×）Fig.3 Microstructure of bast fiber of Linderae Radix from different regions

圖4 不同產地烏藥木纖維顯微特征（40×）Fig.4 Microstructure of wood fibers of Linderae Radix from different regions

圖5 不同產地烏藥油細胞顯微特征（40×）Fig.5 Microstructure of eleocyte of Linderae Radix from different regions

圖6 不同產地烏藥石細胞顯微特征（40×）Fig.6 Microstructure of sciereid of Linderae Radix from different regions

圖7 不同產地烏藥糊化淀粉粒顯微特征（40×）Fig.7 Microstructure of Gelatinized starch granules of Linderae Radix from different regions

3 討論

從主要成分含量檢測結果看，本研究提示烏藥地理分布與其“道地性”顯著相關。浙江天臺烏藥中烏藥醚內酯含量最高質量分數為0.34%，去甲異波爾定含量中等。浙江天臺與浙江衢州、江西景德鎮三個產地經度、緯度相近，三者主成分含量較相近，其中烏藥醚內酯的含量隨著經度減小而減少；湖北恩施與湖南懷化兩者雖經度相近，但因為緯度差異，湖南懷化的烏藥醚內酯含量僅為湖北恩施的一半；云南楚雄與其他5個產地經度、緯度差異均較明顯，成分含量存在明顯的差距。上述結果提示，產地的緯度、經度都能顯著影響藥物主成分的含量，產地經緯度與天臺越接近，烏藥醚內酯等主成分含量越道地。黃林芳等[9]對肉蓯蓉進行了生態研究，發現不同經緯度肉蓯蓉主成分含量存在明顯差異，亦說明地理分布確實能影響藥材的“道地性”。

從顯微性狀特征看，地理位置分布與烏藥“道地性”亦存在顯著相關性，產地經緯度與天臺越接近，烏藥顯微特征越道地。浙江天臺烏藥淀粉粒、油細胞較多，木纖維中亦含有豐富的淀粉粒，但不含石細胞；浙江天臺、浙江衢州、江西景德鎮三個產地經度、緯度明顯相近，三者顯微特征皆較相似，其中淀粉粒個數隨著經度減小而減少；湖北恩施與湖南懷化兩者經度相近，顯微特征比較相似，均含有大量糊化淀粉粒，少量石細胞，較少的油細胞和淀粉粒，且木纖維中淀粉粒較少；云南楚雄與其他5個產地經度、緯度相差較大，其所產烏藥顯微差異顯著，其淀粉粒極多，多呈團簇狀，木纖維中淀粉粒常見，而且顆粒較大，油細胞較少，偶見石細胞。王旭紅等[10]研究認為烏藥塊根、直根中無石細胞；但筆者觀察到了少量石細胞，與房志堅等[11]研究結論一致。綜上所述，產地經緯度對藥物顯微特征的影響較大，經緯度相似的產地所產烏藥的顯微特征相近，經度越小淀粉粒越少，石細胞越多（云南楚雄除外）；另外，淀粉粒、糊化淀粉粒和石細胞可作為不同產地烏藥藥材的顯微鑒別特征指標。

研究表明，氣候相似是保障藥材品質的基本條件[12]。經度、緯度不同直接導致太陽輻射和海陸分布不同，造成不同地段氣候條件的主要因子——光照、溫度、水分等的差異，形成了不同的緯度地帶性和經度地帶性氣候環境，這可能是造成不同產地藥材主成分含量與顯微性狀差異的關鍵原因，也是造成藥材“道地性”的根本原因。本研究也證實，不同產地經緯度不同，所產烏藥主成分含量不同，顯微性狀也存在顯著差異；烏藥品質差異與地理分布明顯相關，天臺特殊的氣候條件造就了天臺烏藥獨特的生理生化特征。

綜上所述，本研究結果提示可將烏藥醚內酯含量高，淀粉粒較多、油細胞較多，不含石細胞，作為道地烏藥獨特的綜合性指標。另外，依據《中華人民共和國藥典》規定的標準：烏藥醚內酯不少于0.03%，去甲異波爾定不少于0.40%[6]，本研究中云南烏藥所含烏藥醚內酯為0.01%，去甲異波爾定為0.01%，不能應用于臨床。