基于網絡藥理學和分子對接技術的白芍治療抑郁癥作用機制探討△

張景霞，趙重博，李凡，李雅娟，王衛鋒，李莎莎，李芳*

1.陜西中醫藥大學 藥學院，陜西 咸陽 712046；2.陜西省中醫藥研究院，陜西 西安 710003

抑郁癥是最常見的精神疾病，患者表現為心情持久低落、悲觀，多伴有睡眠障礙、身體不適、思維遲緩等，癡呆患病率高，神經心理學測試受損較大，嚴重會產生自殺想法[1]。近年來，抑郁癥的發病率逐年上升，其發病機制尚不明確[2]。中醫主治抑郁癥多為疏肝理氣、解郁[3]。白芍為毛茛科植物，有養血斂陰、平抑肝陽、柔肝止痛的作用，現代藥理作用有抗炎、抗氧化、抗抑郁[4]等，在臨床常配伍使用。研究表明，白芍中的有效成分具有明顯的抗抑郁作用[5-12]，但其機制需要進一步闡明。多成分、多靶點、多通路是中醫藥治療疾病的特點，因此，本研究運用網絡藥理學和分子對接手段[13]，探討白芍治療抑郁癥可能的靶點和作用機制，為中醫藥治療抑郁癥的相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 潛在活性成分及靶點篩選

通過中藥系統藥理學與分析平臺（TCMSP，http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）檢索“白芍”，得到白芍的化學成分，以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 為篩選條件[3,14]，得到白芍主要化學成分及相關靶點，并通過UniProt數據庫（http//www.uniprot.org/）規范名稱。

1.2 抑郁癥靶點的獲取

在GeneCards 數據庫（https://www.genecards.org/）和DisGeNET 數據庫（https://www.disgenet.org/）檢索“depression”，物種設定為人類，得到抑郁癥相關靶點。

1.3 白芍靶點與疾病靶點韋恩（Venn）分析

將白芍主要化學成分的作用靶點與抑郁癥疾病靶點數據集進行Venn 分析，得到白芍活性成分與抑郁癥的靶向關系。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡構建

將得到的交集靶點導入STRING 數據庫，物種設為“Homosapiens”，中等置信度（medium confidence）設為0.4，其余參數為默認值，構建PPI網絡圖，利用“Networkanalysis”功能進行網絡的拓撲屬性分析，根據其節點度（degree）值明確靶點間作用關系。

1.5 生物過程注釋及代謝通路分析

通過R Studio 軟件進行京都基因與基因組百科全書（KEGG）和基因本體（GO）富集分析。GO富集分析描述了基因靶點的分子功能（MF）、細胞組成（CC）和參與的生物過程（BP），將MF、CC和BP均設Pvalue Cutoff為0.05；用KEGG 數據庫富集靶點基因參與的主要代謝途徑，通路富集分析設定Pvalue Cutoff為0.05。

1.6 分子對接

在PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載活性成分的3D 結構；從RCSB PDB（http://www.rcsb.org/）數據庫中篩選得到核心靶蛋白的晶體結構，去除水分子和配體小分子，分離出潛在蛋白的結構。在Discovery Studio 2016軟件中采用LibDock 程序對接，根據化合物及蛋白質分子設定對接空腔和大小，其余參數保持默認值進行分子對接。

2 結果與分析

2.1 有效成分的獲取與篩選

通過TCMSP 數據庫獲取白芍中85 個化學成分。根據OB≥30%、DL≥0.18 篩選得到有效成分13 個，再根據抑郁癥的潛在靶點和白芍相關靶點的交集映射反推白芍可能具有治療作用的有效成分共8 個，化合物信息見表1。

表1 白芍治療抑郁癥的有效成分

2.2 疾病及藥物靶點篩選

通過GeneCards 和DisGeNET 數據庫檢索得到抑郁癥相關靶點共9785個，與77個白芍潛在靶點進行匹配，通過Venny 2.1.0 映射最終得到交集靶點67個（圖1）。

圖1 白芍成分靶點及抑郁癥疾病靶點韋恩圖

2.3 PPI網絡建立

將67 個交集基因名導入SRTING 數據庫，下載TSV 文本導入Cytoscape 3.7.2 軟件，得到PPI 網絡圖（圖2），共67 個節點、422 條邊，蛋白激酶B1（Akt1）和白細胞介素-6（IL-6）與其他靶點聯系最多，度值最高，處于核心地位，其次是絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、前列腺素G/H 合成酶2（PTGS2）、轉錄因子AP-1（JUN）和腫瘤壞死因子（TNF）等。

圖2 白芍治療抑郁癥關鍵靶點的PPI網絡

2.4 GO功能和KEGG通路富集分析

GO 富集分析結果表明，白芍治療抑郁癥67 個關鍵靶點主要集中在BP 上，共2825 條富集結果，其中對脂多糖的反應、細菌源分子的反應和對抗生素的反應參與的基因數目最多；CC 中有189 條富集結果，其中靶點參與最多的是膜筏、膜區和突觸后膜；MF 中有71 條富集結果，其中神經遞質受體所占比重較大，其與神經遞質結合并傳遞信號，改變細胞活動；還涉及銨離子結合、突觸后神經遞質受體活動和G 蛋白偶聯神經遞質受體活動等過程。推測白芍可能通過調節機體以上多種生物過程而發揮抗抑郁作用。排名前10位的GO分析結果見圖3。

圖3 白芍治療抑郁癥活性靶點GO富集分析

對67 個靶點進行KEGG 通路富集分析，共得到209 條富集結果，篩選P<0.05，排名前20 的通路G為候選信號通路，主要涉及糖基化終末產物及其受體（AGE-RAGE）信號通路、神經活性配體-受體相互作用信號通路、TNF信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-Akt信號通路等，推測白芍可能通過作用于多種疾病通路、信號通路發揮抗抑郁作用（圖4）。

圖4 白芍治療抑郁癥活性靶點KEGG通路富集分析

2.5 藥物-成分-靶點-通路網絡

利用Cytoscape 3.7.2 中的Merge 功能將藥物-成分、成分-靶點、靶點-通路網絡合并，得到藥物-成分-靶點-通路網絡，見圖5。根據網絡圖分析得知，通路AGE-RAGE 和神經活性配體-受體相互作用與潛在靶點存在較多的連接（表2）。度值排名前5 位的化合物為山柰酚、β-谷甾醇、兒茶酚、芍藥苷和谷甾醇，分別能與44、30、6、3、2 個靶點蛋白發生作用。芍藥二酮、山柰酚、谷甾醇、β-谷甾醇、丁字香萜均作用于靶點PGR。

表2 白芍治療抑郁癥的代謝通路與靶點

圖5 白芍治療抑郁癥的藥物-成分-靶點-通路網絡

2.6 分子對接分析

根據藥材-成分-靶點-通路網絡選取活性成分連接靶點數較多的成分，β-谷甾醇、丁子香萜、谷甾醇、芍藥二酮和山柰酚均作用于靶點PGR，利用Discovery Studio 2016 軟件進行對接驗證，見表3、圖6。丁字香萜能夠與PGR 中ALA211、PRO210、PHE241、TYR63等氨基酸殘基結合，產生氫鍵和共軛效應，增加了結構的穩定性，配體受體結合得分較高；β-谷甾醇能夠與LYS58、TYR63、PHE241 等位點結合形成大量的氫鍵，親和力較好；谷甾醇與TYR63、PRO235、TYR26等位點結合；芍藥二酮與PRO235、TYR27、TYR26等位點結合。表明各活性成分與靶點PGR 具有良好的親和力，這與藥物-成分-靶點-通路網絡分析結果一致。

圖6 白芍中化合物與治療抑郁癥的潛在靶點分子對接

表3 白芍中化合物與治療抑郁癥的潛在靶點分子對接結果

3 討論

本研究通過網絡藥理學方法篩選了白芍的8 個活性成分，預測67 個治療抑郁癥的潛在靶點。根據藥物-成分-靶點-通路網絡度值排名推測化合物谷甾醇、山柰酚及靶點轉錄因子p65（RELA）、Akt1、TNF、MAPK8、半胱氨酸蛋白酶-3（CASP3）、JUN和IL-6 可能是白芍配伍治療抑郁癥的關鍵化合物和靶點；PPI 網絡拓撲學分析結果表明，IL-6 和Akt1與其他靶點的連接最多，IL-6 可誘導淋巴細胞產生免疫球蛋白，作用于B 細胞、T 細胞、肝細胞和中樞神經系統細胞[15]，主要功能是參與炎癥反應及造血過程、刺激活化B 細胞增殖等[16]。研究證實，抑郁障礙患者前額皮質區IL-6 mRNA 和蛋白表達水平升高[17]；Akt1 是一種下游酶，通過調節其下游效應物糖原合成酶激酶-3（GSK-3）來促進生長因子介導的細胞存活和阻止細胞凋亡死亡[18]，研究表明，Akt1 合成的GSK-3 具有抗抑郁作用[18-19]。GO 富集結果顯示，白芍發揮抗抑郁作用的生物過程為參與調節膜電位、銨離子、G 蛋白偶聯受體信號途徑及調節胞漿鈣離子濃度等。KEGG 富集結果顯示，在AGE-RAGE 信號通路、PI3K-Akt和TNF 信號通路上集中著白芍抗抑郁較多的靶點。選取成分β-谷甾醇、丁子香萜、谷甾醇、芍藥二酮和山柰酚與靶點PGR分子對接，結果表明，PGR 與這些化合物有較好對接活性。

臨床研究表明，抗抑郁劑可通過上調5-羥色胺（5-HT）、腦源性神經營養因子（BDNF）的水平以促進海馬神經元新生[20]，增加海馬齒狀回前體細胞數量來發揮抗抑郁作用[21]。白芍可使海馬組織中單胺類神經遞質去甲腎上腺素（NE）和5-HT 的水平明顯升高，并且使5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）的水平明顯降低，達到抗抑郁的作用[22]。β-谷甾醇能顯著增加腦內5-HT、NE 和代謝產物5-HIAA 水平，有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、解熱、免疫調節、止痛的作用，且其與潛在靶點高度聯系[23]。β-谷甾醇的抗抑郁活性是由5-HT、NE 和代謝產物5-HIAA 等神經遞質介導的[24]；山柰酚是一類黃酮醇類化合物，具有較強的抗炎、抗糖尿病、抗癌及神經保護等作用，研究表明，其能通過抗炎、抗氧化及降低海馬神經元的凋亡率來減輕抑郁癥模型大鼠海馬體的損傷。從靶點角度來看，RELA、Akt1、TNF、MAPK8、CASP3、JUN 度值連接次數均在15 次以上，推測其為抗抑郁治療的關鍵靶點。MAPK8參與細胞各種過程，如增殖、分化、遷移及程序性細胞死亡，且已被證實在行為、學習和記憶等方面起到關鍵調節作用[25]；Akt1 通過調節其下游效應物糖原合成GSK-3達到抗抑郁的作用[18-19]。綜上，推測白芍通過多成分、多靶點協同發揮抗抑郁作用。

神經活性配體-受體相互作用信號通路能通過改進神經遞質的傳導功能發揮抗抑郁作用[26]，為質膜上通路的受體及配體[27]；小鼠前額葉灰質和海馬內的基因表達差異主要集中在該通路上[28]。PI3K-Akt信號通路是BDNF/酪氨酸激酶受體B（TrkB）的下游信號通路，被認為是治療抑郁癥的重要信號通路[29]，Akt 為重要樞紐，能夠促進核轉錄因子-κB（NF-κB）蛋白表達，使炎癥反應失調而加重抑郁癥狀[30]；研究表明，抑郁與促炎細胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）及抗炎因子（IL-2、IL-4）的免疫激活及分泌之間存在因果關系[31]；綜上，推測白芍通過多種疾病多條通路發揮抗抑郁作用。

本研究預測了白芍治療抑郁癥的可行性，進一步明確了其多成分、多靶點、多途徑治療的特點，但關鍵生物過程和關鍵途徑的調控仍需深入研究，后續應通過體外細胞實驗和體內動物實驗等驗證，確保預測結果的科學性和正確性。