親水性色譜測定大黃魚中ATP及關聯產物的研究

◎ 方周吉，張茹茹，余永康，蔡瑞鑫，張慧恩

（浙江萬里學院 生物與環境學院，浙江 寧波 315100）

新鮮度是評判水產品質量優劣的重要指標，目前新鮮度的評價方法通常有感官評定法、微生物評價法、化學分析法等。各方法之間，評價結果差異較大。2014年原農業部發布了魚類鮮度指標K值測定的水產行業標準SC/T 3048—2014，K值指標是目前衡量魚類鮮度最常用的指標[1]。K值是以魚體內核苷酸分解過程中產生的多種次級產物含量變化情況作為鮮度的判斷依據。活體魚類肌肉中含有大量三磷酸腺苷（ATP），魚死后體內所含的ATP在酶和微生物的共同作用下發生分解，依次會產生二磷酸腺苷（ADP）、一磷酸（AMP）、肌苷酸（IMP）、次黃嘌呤核苷（HxR）和次黃嘌呤（Hx）。K值是指次級產物中的次黃嘌呤核苷（HxR）、次黃嘌呤（Hx）量之和與ATP及次級產物總量的比值。K值的大小能反映核苷酸類物質在魚體內的分解程度，是魚類鮮度評價的重要指標，一般認為K值在20%以下的魚為鮮度良好。測定K值需要將魚體中6種核苷酸及次級代謝產物都測定出來。目前，K值的測定方法主要有離子色譜法、電泳法、反相液相色譜法等。其中最常用的是反相液相色譜法，反相高效液相色譜法具有操作簡單、儀器普及率高等優點，水產行業標準SC/T 3048—2014魚類鮮度指標K值的測定就是用反相高效液相色譜法測定K值。但是，傳統的反相高效液相色譜法分離ATP及次級產物時，各組分之間的分離度較低，這是因為ATP及次級產物極性較大，在反相色譜柱上很難保留，分析時要在高水相條件下進行分析，這使得色譜柱對各組分缺乏了選擇性，達不到完全分離的效果。而親水性色譜（HILIC）是一種用來提高強極性物質在色譜柱上保留的技術。它采用特殊的強極性固定相，結合高比例有機相來實現強極性物質的分離分析，親水性色譜適用于分離測定強極性化合物[2-7]。

大黃魚是我國重要的海水養殖魚類，養殖產量居我國海水養殖魚類首位。大黃魚以其肉質細嫩鮮美、蛋白質高、膽固醇低而著稱。大黃魚捕撈出水，基本已死亡，市場上大都以冰鮮銷售，新鮮度很難以感官評價進行判斷。因此，測定冰鮮大黃魚魚肉中的核苷酸及多種次級產物，以K值為指標評價大黃魚的新鮮度是非常必要的[8]。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

Waters 2695液相色譜儀（美國Waters公司，配置二極管陣列檢測器）、JY92-ⅡDN超聲波細胞粉碎機（寧波新芝）、5810R離心機（德國Eppendorf公司）、FE28 pH計（梅特勒）及高速組DS-1織搗碎儀（偉嘉儀器）。

1.2 材料與試劑

大黃魚：購于寧波水產品批發市場，冰塊保藏，2 h內到達實驗室，-80 ℃保存。

標準品：ATP、ADP、AMP、Hx、HxR和IMP，購自源葉生物；乙腈為Fisher色譜純；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、高氯酸、氫氧化鉀為國藥集團分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品提取

取魚背脊上的魚肉去皮去骨后，均質，稱取5.00 g，放入50 mL離心管中，加入預冷的高氯酸溶液（10%）20 mL，超聲波細胞粉碎機提取10 min。8 000 r·min-1，4 ℃離心20 min，取出上清液。再用10 mL高氯酸溶液（10%）提取沉淀物，離心，合并上清液，用KOH溶液調pH至6.5，用流動相定容至50 mL，0.22 μm微孔濾膜過濾，待上機。

1.3.2 標準曲線制作

用流動相配制標準工作溶液，ATP、ADP、AMP、Hx、HxR和IMP每種標樣的濃度梯度為5.0 μmol·L-1、10.0 μmol·L-1、20.0 μmol·L-1、50.0 μmol·L-1、100.0 μmol·L-1和200.0 μmol·L-1，進樣量20 μL，上機測定，以峰面積與濃度作標準工作曲線。

1.3.3 色譜條件

親水性色譜柱：BEH Amide（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：A 2.0 mmol·L-1磷酸二氫鉀，B乙腈；洗脫方式：等度洗脫，A 20%，B 80%；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃，檢測波長：254 nm；進樣量：20 μL。以組分保留時間定性，以峰面積定量。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

流動相的確定，以不同濃度磷酸二氫鉀溶液（0.5 mmol·L-1、1.0 mmol·L-1、2.0 mmol·L-1、3.0 mmol·L-1、5.0 mmol·L-1）作為流動相，測定ATP、ADP、AMP、Hx、HxR和IMP的分離情況。磷酸二氫鉀的濃度主要影響流動相的pH值，分析物的解離程度受流動相pH影響很大，在色譜分析過程中，只有當ATP等物質以分子形式存在時，才能在色譜分離中得到較好的峰形和分離情況。實驗表明，當磷酸二氫鉀濃度在2.0 mmol·L-1時能夠使ATP等物質解離抑制，大部分以分子形式存在。在親水性色譜中，流動相中水相比例越高，洗脫能力越強，這與傳統反相色譜剛好相反，流動相中含有大量的有機相，使親水性色譜的選擇性提高。實驗表明，水相比例在20%時，各物質之間能夠得到較好的分離。因此，流動相的組成選擇為2.0 mmol·L-1磷酸二氫鉀∶乙腈為20∶80。ATP、ADP、AMP、Hx、HxR和IMP保留時間分別為14.73 min、12.71 min、10.89 min、6.21 min、7.62 min和11.63 min。親水性色譜與標準SC/T 3048—2014中反相色譜的出峰順序不同，各物質分離度提高[1]。

2.2 線性回歸、檢出限及定量限

實驗對6種化合物進行外標法定量，制作回歸曲線，得到相關系數。以6種化合物的濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標進行線性回歸，得到回歸方程及相關系數，并確定方法檢出限（S/N）＞3和定量限（S/N）＞10，結果見表1。可知6種物質均呈現良好的線性關系。色譜圖見圖1和圖2。

表1 回歸方程、線性相關系數、檢出限和定量限表

圖1 標樣色譜圖

圖2 大黃魚樣品色譜圖

2.3 加標回收率及精密度實驗

將標準品加入到5.00 g樣品中，配制成高2.0 μmol·g-1、中0.5 μmol·g-1、低0.2 μmol·g-1的3個濃度加標量，進行樣品提取和色譜分析，每個加標量做3個平行，計算回收率。由表2可見，本方法對6種化合物的回收率均在90.2%～106.3%，相對標準偏差在0.8%～4.2%，重現性和精密度較好。

表2 加標回收率和精密度表（n=3）

（續表2）

3 結論

對水產品中ATP及關聯產物的測定，現行有效的行業標準SC/T 3048—2014采用反相色譜分析法，使用純水相作為流動相，各物質之間很難完全分離。本研究利用親水性色譜對ATP及關聯產物進行分析，親水性色譜使用較高含量的有機相作為流動相，使色譜柱對各物質的保留特性有較大的差異，使各物質得到較好的分離，得到較好的效果。此方法簡單、準確、回收率高、精確度高。